UPLC-MS/MS测定猪肉中3种β-受体激动剂残留量

张加稳，白文莉*

（昆明市食品药品检验研究院，云南 昆明 650000）

β-受体激动剂是一类具有肾上腺素功能的苯乙醇胺类人工合成物质[1]，能有效提高养殖动物饲料转化率和瘦肉率，常被非法用于动物养殖过程，人们食用残留有一定剂量的β-受体激动剂肉制品后会出现不同程度的中毒反应，如面色潮红、四肢麻木等，严重的可能危及到生命[2-3]。因此，国家和主管农业部门加大了对β-受体激动剂的监管力度，2002年2月，原农业部、卫生部、国家药品监督管理局联合发布《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》（农业部公告第176号），明确将盐酸克伦特罗、莱克多巴胺等7种β-受体激动剂列入目录[4]。

目前国内外动物源性食品中β-受体激动剂的检测方法[5-6]主要有酶联免疫法（enzyme-linked immunosorbent as say，ELISA）、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）、气相色谱-串联质谱联用法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）、高效液相色谱-串联质谱联用法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS/MS）。酶联免疫法（ELISA）[7-9]适用于大批量样品的快速筛查，样品前处理相对简单，所需仪器化程度低，但检验过程易出现假阳性结果，因此用该方法检测到的阳性样品需要用其他仪器方法进行确认。高效液相色谱法（HPLC）[10]分离度好、专属性强，但样品前处理和试剂要求较高，基质干扰较大，也容易出现假阳性结果。气相色谱-质谱联用法（GC-MS）[11-13]能在多种β-受体激动剂同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析，与HPLC法相比，检测灵敏度较高，假阳性概率更低，但GC-MS适用于挥发性成分检测，前处理需要衍生化，过程较繁琐，检测耗时长，样品回收率也得不到保证。GC-MS[11-12]要求较高，基质干扰较大，也容易出现假阳性结果。高效液相色谱-串联质谱联用法（HPLC-MS/MS）[14-15]与其他检测方法相比，具有适用范围广、准确，灵敏度高、分析周期短等优点，已被越来越多地应用于动物源性食品中β-受体激动剂的检测和确认。目前GB/T 22286—2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》[16]被广泛用于监督检测中，但该标准方法在前处理过程未对肉制品进行去除油脂处理，而是直接提取净化，这样做既会对样品回收率造成影响，同时还易造成液相色谱柱堵塞。此外，已报道的文献[17-21]对目标物提取溶剂和净化方式差异较大，提取回收率高低不同。本实验在GB/T 22286—2008的基础上，选择在猪肉基质中添加克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇3种β-受体激动剂进行研究，先用正己烷对加标样品做去除油脂处理，然后对其提取溶剂和固相萃取净化柱作优化研究，最终建立了超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatographytriple quadrupole tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）的检测方法，具有定性和定量准确可靠、高灵敏度、基质干扰小等优点，可为动物源性食品中β-受体激动剂的检测分析提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷、异丙醇（均为色谱纯）：默克股份两合公司；石油醚（分析纯）：西陇科学股份有限公司；氯化钠、氢氧化钠、无水醋酸钠、盐酸、氨水、甲酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；β-葡萄糖醛甙酶（分析纯）：Helix pomatia公司。猪肉样品：市场抽检。

克伦特罗标准品（纯度＞98%）：德国E.Q.公司；沙丁胺醇标准品（纯度＞98%）：中国食品药品检定研究院；莱克多巴胺标准品（纯度＞98%）：美国Stanford Chemicals公司。

6cc 150 mg SCX、6cc 150 mg WCX、6cc 150 mg PCX、6cc 150mgMCX固相萃取柱：美国Waters公司；C18色谱柱（2.1mm×150 mm，1.8μm）：美国Agilent公司；PES滤膜（0.22 μm）：天津津腾有限公司。

1.2 仪器与设备

EXION-QTRAP4500超高效液相-串联质谱联用仪：美国AB公司；SK8210HP超声波清洗仪：上海科导超声仪器有限公司；Reacti-Therm氮吹仪：美国Thermo Scientific公司；Allegra X-30R高速离心机：美国贝克曼公司；JJ500电子天平：常熟市双杰测试仪器厂；MF10组织捣碎机：德国IKA公司；S220K pH计：梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；HH-6恒温水浴锅：金坛市科析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

准确量取100 μg/mL的克伦特罗＋沙丁胺醇＋莱克多巴胺混合标准溶液1 mL，用乙腈稀释定容至100 mL，配制成质量浓度为1 μg/mL的标准储备液，于4 ℃冰箱保存。准确量取1 μg/mL标准储备液，用体积分数30%乙腈依次稀释成5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL的系列标准工作溶液，避光4 ℃条件下保存，待用。

1.3.2 样品前处理

（1）提取：准确称取样品约2 g（精确至0.01 g）置于50 mL离心管中，加入10 mL正己烷超声10 min去除油脂处理后，加入8 mL乙酸钠缓冲液，充分混匀，加入50 μLβ-葡萄糖醛甙酶于离心管中，混匀后，37 ℃条件下水浴水解12 h。

水解完成后，取出离心管，于水平振荡器上振荡15 min，5 000 r/min离心10 min，取4 mL上清液于另一离心管中，加入0.1 mol/L高氯酸溶液5 mL，混合均匀，用高氯酸调节pH值至1±0.3，5 000 r/min离心10 min，转移全部上清液于50 mL离心管中，用10 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至11，加入10 mL饱和氯化钠溶液和10 mL异丙醇-乙酸乙酯（6∶4，V/V）混合溶液，充分超声提取5 min，5 000 r/min离心10 min，转移有机相至另一50 mL离心管中，重复提取一次，合并有机相，于40 ℃水浴中氮气吹干，加入5 mL乙酸钠缓冲液，超声混匀，残渣充分溶解后备用。

（2）净化：用3 mL甲醇和3 mL水活化MCX阳离子交换柱，将上述待测溶液过柱，依次用2 mL水、2 mL 2%甲酸水溶液和2 mL甲醇洗涤柱子并彻底抽干，再用2 mL 5%的氨水甲醇溶液洗脱柱子上的待测成分，洗脱液在40 ℃水浴条件下氮气吹干，最后用1 mL 0.1%甲酸/水-乙腈（70∶30，V/V）超声溶解，过0.22 μm微孔滤膜，超高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3.3 超高效液相色谱-串联质谱条件

（1）超高效液相色谱条件为流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量10 μL；流动相A为含0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈，洗脱梯度见表1。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions

（2）电喷雾离子化串联质谱（electrospray ionization tandem mass spectrometry，ESI-MS/MS）条件：正离子扫描；质谱多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；气帘气，离子源雾化气，离子源辅助加热气，分别设定为38 L/h、55 L/h、55 L/h，喷雾电压5 500 V，加热器温度为550 ℃；优化后的监测离子对（m/z）、去簇电压（declusteringpotential，DP）、碰撞能量（collision energy，CE）、驻留时间等参数见表2。

表2 3种β-受体激动剂保留时间及质谱参数Table 2 Retention time and mass spectrometry parameters of three β-receptor agonists

2 结果与分析

2.1 仪器条件优化

该类化合物分子结构中均含有胺基和羟基基团，在质谱检测离子化过程中，容易形成稳定的[M+H]+离子，故采用电喷雾电离（electrospray ionization，ESI+）正离子扫描模式。优化过程用体积分数50%乙腈水溶液将1 μg/mL混合标准储备溶液稀释成约为200 ng/mL的溶液，针泵恒流注射进样，设置一定的质谱参数，分别扫描3种化合物的母离子Q1和子离子Q3，选取两对离子丰度较强、干扰较小的特征离子对来同时定性，避免假阳性结果的发生，再选取其中离子丰度最强的一对离子对来进行定量，保证定量的准确性。最后对确定的Q1和Q3来优化去簇电压、碰撞能量、驻留时间等参数，建立完整的质谱参数。

正离子扫描模式下，在液相色谱流动相中加入少量的甲酸会增强待测化合物的响应强度，原因是甲酸会电离出更多的H+。因此本实验选用0.1%的甲酸水溶液与乙腈为流动相，由于3种化合物的极性比较相近，故采用较长的C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）进行梯度洗脱，从而保证各个化合物有较好的峰形、分离度和响应强度。建立优化后的超高效液相色谱参数和质谱参数后对混合标准溶液、加标样品溶液和空白样品溶液采集的离子色谱峰图分别如图1所示。

图1 混合标液（A）、加标样品（B）、空白样品（C）的UPLC-MS/MS色谱图Fig.1 UPLC-MS/MS chromatogram of mixed standard (A),adding standard sample (B) and blank sample (C)

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂的优化

图2 不同比例异丙醇-乙酸乙酯克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺提取回收率的影响Fig.2 Effct of different proportions of isopropanol-ethyl acetate on the extraction recovery rate of clenbuterol,salbutamol and ractopamine

克伦特罗、沙丁胺醇、和莱克多巴胺分子结构均由苯环连接着胺基和羟基构成，属于中等极性化合物，本实验考察了异丙醇-乙酸乙酯两种中等极性的溶剂以（10∶0、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、0∶10，V/V）等不同比例混合后提取效率的高低，结果如图2所示。从图2可以看出，异丙醇-乙酸乙酯（6∶4，V/V）混合液提取效果最好，3种β-受体激动剂的回收率依次为78.7%、88.9%、83.4%，此结果进一步验证了GB/T 22286—2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》所用异丙醇-乙酸乙酯（6∶4，V/V）混合溶液作为提取溶剂的正确性。

2.2.2 净化条件的优化

本实验在前处理过程中，采用4种不同的阳离子交换小柱（WCX、PCX、SCX及MCX）对目标提取液进行净化萃取，比较其对克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺的净化效果，结果如图3所示。从图3可以看出，采用MCX固相萃取柱的净化效果最好，样品中3种β-受体激动剂的回收率均在70%以上，原因可能是MCX填料对3种化合物所形成的[M+H]+离子吸附作用较强，且易于洗脱。因此本实验选择MCX作为固相净化柱。

图3 不同净化柱下克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺的提取回收率Fig.3 Extraction recovery rate of clenbuterol,salbutamol and ractopamine under different purification columns

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系及检出限

采用外标法定量，以目标物的质量浓度（x）作为横坐标，目标物定量离子对的峰面积（y）作为纵坐标绘制标准曲线。3种化合物的线性方程、相关系数、检出限及定量限见表3。

表3 3种β-受体激动剂的线性方程、相关系数及检出限Table 3 Linear equations,correlation coefficients and detection limits of three β-receptor agonists

由表3可知，3种β-受体激动剂混合标准液的质量浓度范围在5～100 ng/mL，相关系数R2均＞0.99。在空白猪肉样品中加入3种混合标液，经过萃取浓缩和净化后进行仪器检测，以3倍信噪比为方法检出限。目前，国家标准GB/T 22286—2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》[16]中对克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺残留量的检出限均为0.5 μg/kg，因此本实验建立的肉制品中β-受体激动剂残留量的检测方法符合国家标准的检测要求。

2.3.2 回收率和精密度

在猪肉中分别添加0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、5.0 μg/kg 3个浓度水平的混合标准溶液，每个水平进行6次平行实验，按照优化的实验方法测定，计算其加标回收率及精密度，实验结果见表4。3种β-受体激动剂的平均回收率均为81.8%～103.1%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均＜10%，其加标回收率和精密度均符合GB/T 27404—2008规定的要求[22]。

表4 加标回收率实验结果（n=6）Table 4 Results of adding standard recovery rate test (n=6)

3 结论

本实验建立了超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法同时测定猪肉中克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺残留量的分析方法，分别对提取溶剂、固相萃取柱、液相色谱和质谱参数进行了优化。该方法先用正己烷去除样品中油脂，再用异丙醇-乙酸乙酯（6∶4，V/V）混合液萃取浓缩，最后用MCX固相萃取柱进一步净化，有效减弱了基质效应，提高了检测方法的灵敏度和准确度。3种β-受体激动剂的平均回收率在81.8%～103.1%，相对标准偏差均＜10%，表明该方法回收率高和重复性好，能够满足国外相关法规的要求，适合大批量猪肉中β-受体激动剂残留量的检测分析。