不同年份陈皮黄酮成分分析及抗氧化活性评价

刘丽娜 徐玉娟 肖更生 吴继军 余元善 傅曼琴

摘要：【目的】研究不同贮藏年份陈皮中黄酮类物质及其抗氧化活性的差异，为陈皮的品质鉴定及调控提供参考依据。【方法】以贮藏1年（2017年产）、5年（2013年产）和15年（2003年产）的新会陈皮为研究对象，采用乙醇超声法提取陈皮总黄酮，高效液相色谱法（HPLC）分析总黄酮成分，并采用2，2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐（ABTS）、FRAP（铁离子还原/抗氧化能力）和DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）法评价陈皮总黄酮的抗氧化活性。【结果】贮藏15年间，陈皮总黄酮含量从3.93±0.07 mg RE/g显著增加到6.66±0.12 mg RE/g（P<0.05，下同），增长率为69.47%;不同年份陈皮总黄酮的ABTS、FRAP和DPPH值均呈增长趋势，且年份间差异显著，以ABTS值最大，其次是FRAP值，DPPH值最小。橙皮苷、川陈皮素和桔皮素的保留时间分别为7.8、17.7和19.4 min，且3种主要黄酮类物质成分含量随陈皮贮藏时间的延长显著增加，其中橙皮苷含量在15年间增加2.61倍，川陈皮素含量增加62.74%，桔皮素含量增加了55.50%;在贮藏1年和5年的陈皮中，3种主要黄酮类物质含量排序为川陈皮素>桔皮素>橙皮苷;而在15年陈皮中，其含量排序为橙皮苷>川陈皮素>桔皮素。【结论】随着陈皮贮藏时间的延长，其总黄酮含量显著增加，抗氧化能力增强，橙皮苷、川陈皮素和桔皮素3种主要的黄酮类物质含量递增。这一变化规律可为阐释陈皮“陈久者良”的科学内涵提供理论依据，对研究陈皮陈化品质的形成及其调控具有参考价值。

关键词： 陈皮;黄酮;贮藏年份;抗氧化;高效液相色谱法

0 引言

【研究意义】陈皮（Pericarpium Citri Reticulatae，PCR）是芸香科植物橘（Citrus reticulate Blanco）及其栽培变种的干燥成熟果皮（陈琳等，2015），是广东道地药材，位居“广东三宝”之首。《绍兴本草》曾报道“唯橘皮以陈久者佳”，中医理论也认为随着陈皮贮藏年限的增加，其药用价值更高（国家药典委员会，2015）。陈皮中含有黄酮类化合物、挥发油类、柠檬苦素类、生物碱类、矿物质元素及其他营养物质（欧立娟和刘启德，2006），其中黄酮类化合物具有清除自由基、保护心血管和抗肿瘤等功效（闫文莉，2018）。因此，对不同贮藏年份陈皮进行黄酮成分分析及其活性评价，对于阐释陈皮“陈久者良”的科学内涵具有一定的意义。【前人研究进展】目前的研究主要从不同贮藏年限陈皮化学成分的变化及其影响因素探索等方面对陈皮“陈久者良”进行科学阐释（王福等，2015）。易伦朝等（2005）通过高效液相色谱—二极管阵列检测（HPLC-DAD）技术对不同年份的陈皮样品精油及黄酮类成分进行分析，结果表明不同年份及不同处理的陈皮黄酮类物质无明显变化。郑国栋等（2010）用HPLC对10批不同贮藏年限广陈皮药材中的橙皮苷、川陈皮素、橘皮素等5种黄酮类成分的变化规律进行定量研究，结果表明所选原料中橙皮苷含量均符合国家药典标准（≥35 mg/g），且5种黄酮类物质含量随贮藏时间延长均呈增加趋势。魏莹等（2016）在不同色谱条件下建立了一种测定不同贮存年限（1～19年）广陈皮药材中橙皮苷、川陈皮素、桔皮素和辛弗林含量的HPLC，该方法操作简便、稳定、重复性好，并推测陈皮“陈久者良”可能与上述4种活性成分含量变化无关，与其挥发油含量减少而緩和燥性有关。Fu等（2017）使用HPLC和双波长检测同时测定橙皮苷和5种多甲氧基黄酮的含量，结果表明多甲氧基黄酮可用作评价陈皮存储过程中质量变化的指标，较长的储存期可提高陈皮质量;之后Fu等（2018）通过控制温度和湿度交替储存条件研究陈皮总黄酮、总多酚和多酚分布参数，结果表明，与自然环境条件相比，交替储存条件加速陈皮褐变，增加酚类物质损失，总多酚、总黄酮和橙皮苷含量下降，但5种多甲氧基黄酮和抗氧化活性在整个储存期间均有所增加。段庆等（2019）通过HPLC测定11种不同贮藏年限的新会陈皮提取物中4种黄酮成分含量，并在11种陈皮样品中均检测到这4种黄酮类化合物，得到贮藏时间越长橙皮苷含量越高的结论，为陈皮“陈久者良”提供理论支撑。李文东等（2019）测定19个不同陈皮样品中多甲氧基黄酮川陈皮素和桔皮素含量，结果测得二者含量分别为0.031%～0.968%和0.011%～0.546%，经方法学验证后表明不同品种来源陈皮中多甲氧基黄酮含量有明显差异。【本研究切入点】近年来，在研究陈皮“陈久者良”科学依据的方向上虽然找到了一定依据，但并未明确不同贮藏年份陈皮主要黄酮类化合物的具体差异及陈皮贮藏时间对这些黄酮类化合物的影响。【拟解决的关键问题】以2017、2013和2003年产的新会陈皮为研究对象，探究不同贮藏年份陈皮黄酮成分与抗氧化活性的相关性及差异性，旨在进一步完善陈皮“陈久者良”的科学理论依据，为其品质鉴定及调控提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

2017、2013和2003年产陈皮（对应分别贮藏1年、5年和15年）购自江门市新宝堂陈皮有限公司，均来自同一果园当年12月份所采茶枝柑的果皮。氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠和无水乙醇为分析纯，甲醇为色谱纯，均购自天津市大茂化学试剂厂;总抗氧化能力检测试剂盒[铁离子还原/抗氧化能力（FRAP）法和2，2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐（ABTS）法]购自南京建成生物工程研究所;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、芦丁、橙皮苷、川陈皮素、桔皮素和Trolox标准品均购自美国Sigma公司。

主要仪器设备：SQP电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司];RHP-100高速多功能粉碎机（浙江永康市荣浩工贸有限公司）;HWS-26电热水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）;A-1000S水流抽气机、N-1300旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）;VF204A真空抽滤机（美国圣斯特公司）;DL-800B智能超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）;JW-1042离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）;Bio Tek Gen5酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）;UV1800紫外分光光度计、LC-20AT高效液相色谱仪[岛津仪器（苏州）有限公司]。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 黄酮提取物制备 将3个年份的陈皮样品打粉，分别称取陈皮粉95 g，按料液比1∶10加入90%乙醇提取，50 ℃恒温水浴超声波1 h，减压抽滤后得到滤液和滤渣。对滤渣重复上述操作提取2次，合并滤液，旋转蒸发仪减压浓缩至浓缩液体积约100 mL;浓缩液冷冻干燥得陈皮黄酮提取物，置于干燥器中保存备用。

1. 2. 2 总黄酮测定

1. 2. 2. 1 芦丁标准曲线 使用90%乙醇溶解21.30 mg芦丁标准品，并定容至100 mL，摇匀后得到芦丁标准溶液浓度为0.2130 mg/mL。分别移取芦丁标准溶液0、1、2、3、4、5、6和7 mL置于10 mL容量瓶中，并用90%乙醇定容至刻度线，再分别量取5 mL各浓度的芦丁标准溶液于试管中，加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液，混匀后静置5 min，加入1 mL 10%硝酸铝溶液振荡混合，静置6 min，然后加入4 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液，振荡混匀，45 ℃恒温水浴10 min，冷却，5000 r/min离心5 min，取上清液在505 nm波长下测其吸光值（A），平行重复3次。以芦丁质量浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线，所得线性回归方程为y=4.7386x-0.003（R2=0.999）。

1. 2. 2. 2 黄酮提取物中总黄酮测定 分别称取1.00 g不同年份的陈皮黄酮提取物，加入50 mL 90%乙醇超声溶解、搅拌，得到黄酮提取液。分别取2017、2013和2003年的黄酮提取液4、2和1 mL置于10 mL容量瓶中，并用90%乙醇定容至刻度线，相当于稀释2.5、5.0和10.0倍，然后加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液，混匀，静置5 min后加入1 mL 10%硝酸铝溶液，振荡混匀，静置6 min，再加入4 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液，振荡均匀，45 ℃恒温水浴10 min，冷却，5000 r/min离心5 min，取上清液在505 nm波长下分别测其吸光值，最终的总黄酮含量以芦丁当量（mg RE/g）表示，每种样品平行重复3次。

每克提取物中黄酮含量（mg/g）=（A+0.03）×稀释倍数×50/（4.7386×1）。

陈皮中总黄酮含量（mg/g）=提取物冻干后总质量×每克提取物中黄酮含量/陈皮样品总质量。

1. 2. 3 总黄酮抗氧化能力测定

1. 2. 3. 1 ABTS法 用双蒸水将Trolox标准液分别稀释为0.1、0.2、0.4、0.8和1.0 mmol/L梯度溶液。按照ABTS试剂盒说明进行试验，以标准品OD值为横坐标、各OD值对应的标准品浓度为纵坐标绘制标准曲线。把样品的OD值代入标准曲线，计算其对应的标准品浓度。最终的总抗氧化能力以当量Trolox溶液浓度表示。

1. 2. 3. 2 FRAP法 配制各浓度梯度（0.15、0.30、0.60、0.90、1.20和1.50 mmol/L）的硫酸亚铁标准品溶液。按照FRAP试剂盒使用说明进行试验，以标准品OD值为横坐标、各OD值对应的标准品浓度为纵坐标绘制标准曲线。把样品OD值代入标准曲线，计算其对应的标准品浓度。最终的总抗氧化能力用当量Trolox溶液浓度表示。

1. 2. 3. 3 DPPH法 稱量39.40 mg DPPH标准品，用适量90%乙醇溶解并定容至1 L，得到100 μmol/L的DPPH溶液，避光保存备用。称量10.00 mg Trolox标准品，用90%乙醇溶解并定容至100 mL，得到浓度为0.1 mg/mL的Trolox标准溶液。分别移取2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0 mL原液置于10 mL容量瓶中并用90%乙醇定容，得到一系列不同浓度梯度Trolox标准溶液。

试验分为空白组、样品组和对照组。空白组：以90%乙醇为空白对照（零管），取6 mL 90%乙醇室温避光保存30 min。样品组：5 mL 100 μmol/L DPPH溶液中加入1 mL Trolox标准液（样液），摇匀，室温下避光保存30 min，517 nm处测定吸光值，每组平行重复3次。对照组：取1 mL 90%乙醇加入5 mL 100 μmol/L DPPH溶液中，充分摇匀，室温避光保存30 min后在517 nm处测定吸光值，平行重复3次。

DPPH自由基清除率（%）=[A0-A1A0]×100

式中，A0为1 mL 90%乙醇与5 mL 100 μmol/L DPPH溶液的混合液在517 nm处的吸光值，A1为1 mL标准品（样品）溶液与5 mL 100 μmol/L DPPH溶液的混合液在517 nm处的吸光值。

以Trolox标准品浓度（mmol/L）为横坐标、自由基清除率为纵坐标绘制标准曲线，把样品溶液OD值代入标准曲线，计算其对应的标准品浓度，最终的总抗氧化能力以当量Trolox溶液浓度表示。

1. 2. 4 主要黄酮类物质含量测定

1. 2. 4. 1 标准曲线绘制 严格称取橙皮苷、川陈皮素和桔皮素标准品各20.00 mg，分别置于100 mL容量瓶中，加入甲醇超声溶解并定容、摇匀。准确量取上述标准品溶液1、2、3、4和5 mL分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，摇匀，即得到质量浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 mg/mL的标准品溶液，经HPLC分析。

色谱条件：Waters C18柱（4.6 mm×250 mm），流动相为甲醇∶水，280和330 nm双波长检测，进样体积10 μL，柱温40 ℃;梯度洗脱程序：0～10 min，40%～60%甲醇;10～15 min，60%～80%甲醇;15～20 min，80%～60%甲醇;20～25 min，60%～40%甲醇;25～30 min，40%甲醇;流速1.0 mL/min。

以标准品质量浓度（mg/mL）为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到表1的线性回归方程。

1. 2. 4. 2 样品溶液液相分析 称取1 g黄酮提取物，加入50 mL 90%乙醇超声溶解，得到提取液。分别取1 mL提取液过0.22 ?m微孔滤膜后进行液相分析，色谱条件同1.2.4.1，每个样品重复3次。

1. 3 统计分析

使用SPSS 20.0和OriginPro 8.5对试验数据进行整理分析并制图。

2 结果与分析

2. 1 不同年份陈皮总黄酮含量的差异性分析

由图1可知，2017、2013和2003年陈皮的总黄酮含量间存在显著差异（P<0.05，下同），以2003年陈皮总黄酮含量最高，为6.66±0.12 mg RE/g;其次是2013年陈皮，其含量为6.05±0.01 mg RE/g;2017年陈皮总黄酮含量最低，为3.93±0.07 mg RE/g。2013年陈皮总黄酮含量较2017年陈皮增加53.94%，而2003年陈皮总黄酮含量较2013年陈皮增加仅10.08%，表明陈皮在贮藏期间，总黄酮含量在前5年增加速度较快，而在后10年增加幅度减小，也说明陈皮贮藏前5年是其总黄酮产生的关键时期，可能与陈皮表面微生物在陈皮贮藏早期进行频繁代谢活动有关（刘素娟等，2017）。

2. 2 不同年份陈皮总黄酮的抗氧化活性分析

如图2所示，在贮藏1年、5年到15年间，陈皮总黄酮的ABTS、FRAP和DPPH值均呈增长趋势，且年份间差异显著，说明陈皮贮藏越久其抗氧化活性越高;且3种方法中，ABTS值最大，其次是FRAP值，DPPH值最小。

ABTS与氢过氧化物和过氧化物酶形成ABTS+，而ABTS+与铁—肌红蛋白形成的混合物最大吸收波长在820、734和650 nm处，氢供体存在时，混合物在最大吸收波长处的OD值会下降;而抗氧化剂的抗氧化能力直接影响OD值的下降程度，因此OD值的下降程度能反映抗氧化能力（徐清萍等，2007）。由图2可知，随着陈皮贮藏时间延长，陈皮总黄酮的ABTS值显著增加，2017、2013和2003年的ABTS值分别为4.85±0.08、9.56±0.04和18.50±0.26 mmol TE/g，2003年陈皮总黄酮的抗氧化能力较2017年陈皮增强2.81倍。

FRAP法原理为Fe3+-吡啶三吖嗪（TPTZ）在593 nm处有最大吸收峰，在抗氧化物质作用下还原为Fe2+形式，呈蓝色且吸光值增大。FRAP值越大说明抗氧化剂的还原能力越强（张方乐等，2009）。由图2可知，陈皮总黄酮对铁离子的还原能力随贮藏时间延长呈显著增长趋势，2017、2013和2003年的FRAP值分别为0.92±0.03、2.81±0.03和12.46±0.42 mmol TE/g，说明2003年陈皮总黄酮的还原能力最强，分别是2013和2017年的4.43和13.54倍。

DPPH是有机溶剂中具有单一电子的一种稳定自由基，最大吸收波长为517 nm。自由基清除剂会使DPPH的单电子被捕捉从而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光值也会下降，且呈線性相关，吸光值的降低表明抗氧化性增强，以此评价试验样品的抗氧化能力（杨秀梅等，2014）。由图2可知，随着陈皮贮藏时间的延长，不同年份陈皮总黄酮对DPPH自由基的清除能力显著增强，其中，2003年陈皮总黄酮的清除能力最强，为2.45±0.01 mmol TE/g，是2013年陈皮（1.40±0.01 mmol TE/g）的1.75倍，是2017年陈皮（0.83±0.01 mmol TE/g）的2.95倍。以上结果表明，陈皮抗氧化能力与陈皮贮藏时间密切相关，且贮藏越久其抗氧化能力越强。

2. 3 HPLC分析不同年份陈皮中主要黄酮类物质

按照1.2.4.1的HPLC分析条件，对橙皮苷、川陈皮素和桔皮素标准品及不同年份的陈皮样品进行定性定量分析，将橙皮苷、川陈皮素和桔皮素标准品甲醇溶解后高效液相混标分析，结果如图3所示。由图3-A可知，橙皮苷、川陈皮素和桔皮素的保留时间分别为7.8、17.7和19.4 min，最大吸收波长分别为283、334和325 nm。在2017、2013和2003年贮藏的陈皮样品中均能检测出橙皮苷、川陈皮素和桔皮素，且为主要黄酮类物质;在陈皮贮藏1～5年过程中，橙皮苷检测峰高变化不明显，贮藏15年后，样品中橙皮苷检测峰高明显增加;川陈皮素检测峰高在陈皮贮藏1～5年中明显降低，贮藏5～15年的陈皮，其检测峰高降低不明显;桔皮素在贮藏1～15年的陈皮中峰高变化呈稳定降低趋势（图3-B）。

2. 4 不同年份陈皮中主要黄酮类物质含量的差异性分析

如图4所示，不同年份陈皮中橙皮苷、川陈皮素和桔皮素的含量均存在显著差异，且随着贮藏时间的延长，三者的含量均显著增加。2017、2013和2003年陈皮中橙皮苷含量分别为1.39±0.06、2.26±0.34和5.02±0.07 mg/g，即2013年陈皮中橙皮苷含量是2017年陈皮的1.63倍，2003年陈皮中橙皮苷含量是2013年陈皮的2.22倍，2003年陈皮中橙皮苷含量较2017年陈皮增加2.61倍;2003年陈皮中川陈皮素含量为4.15±0.05 mg/g，较2013年（3.42±0.03 mg/g）增加21.35%，是2017年（2.55±0.06 mg/g）的1.63倍，表明在15年间陈皮中川陈皮素的含量变化相对于橙皮苷的变化幅度小;2017、2013和2003年陈皮中桔皮素含量分别为2.09±0.04、3.00±0.03和3.25±0.03 mg/g，2013年桔皮素含量较2017年增加43.54%，2003年较2013年增加8.33%，说明陈皮在贮藏期间，桔皮素含量的增加速度先快后慢。

对于贮藏1年和5年陈皮，其主要黄酮类物质含量排序为川陈皮素>桔皮素>橙皮苷;而对于15年陈皮，其主要黄酮类物质含量排序为橙皮苷>川陈皮素>桔皮素。

3 讨论

现代药理作用和临床研究均表明，陈皮黄酮有抗氧化、抗肿瘤、抗炎和保护神经等生理作用，在医药、保健食品、香精香料、日化品等领域具有很高的应用价植（李柯柯和任顺成，2017;许珊珊等，2018），因此，从陈皮中提取黄酮类物质已成为研究热点。本研究以贮藏1年（2017年）、5年（2013年）和15年（2003年）的陈皮为对象，提取总黄酮，研究其变化规律及抗氧化活性，结果表明，不同年份陈皮的总黄酮含量不同，2017、2013和2003年陈皮的总黄酮含量分别为3.93±0.07、6.05±0.01和6.66±0.12 mg RE/g，随着贮藏年限的增加，陈皮中总黄酮含量逐渐增加，其中陈皮在1～5年的陈化过程中，总黄酮含量显著增加;在5～15年的陈化过程中，总黄酮含量增速变缓，与林林（2008）的研究结果一致。Wang等（2016）研究老化对陈皮的影响，提取来自代表性陈皮的游离和结合酚类化合物，结果表明，在老化期间，结合的酚类和类黄酮含量显著升高，且其抗氧化活性增加，结合部分增强了老化陈皮的总效益，表现出更高的酚类和类黄酮含量，以及更强的抗氧化活性。由此可见，陈皮在陈化期间，其总黄酮含量随着贮藏时间的延长而增加，可为陈皮“陈久者良”的说法提供科学理论依据。

本研究发现，陈皮贮藏时间由1年（2017年）到5年（2013年）再到15年（2003年），总黄酮含量增加的同时，其对铁离子的还原能力及对ABTS和DPPH自由基的清除能力均呈递增趋势，表明总黄酮含量的增加与其抗氧化活性有密切联系，与Berreca等（2011）的研究结果一致。由于黄酮类物质具有抗氧化、抗菌等功效（Pernice et al.，2009），说明陈皮贮藏时间越长，抗氧化能力越强（Kim et al.，2013）。

陈皮中的黄酮类化合物主要包括橙皮苷、桔皮素和川陈皮素等，同样具有抑菌、抗氧化和抗肿瘤等作用，不仅可用于降低胆固醇、预防动脉粥样硬化等，还可作为保健因子添加到饲料和食品中（王慧芳等，2018）。本研究以3个贮藏年份的陈皮黄酮提取物为对象，分析橙皮苷、桔皮素和川陈皮素的含量变化规律，结果表明，陈皮陈化15年间，橙皮苷含量增加2.61倍，川陈皮素含量增加62.74%，桔皮素含量增加55.50%，3种主要黄酮类物质含量的增加速度由大到小依次为橙皮苷>川陈皮素>桔皮素，与高蓓（2011）的研究结果一致。说明陈皮在陈化过程中，不同黄酮类物质含量会随陈皮贮藏时间的延长而发生变化，因其具有抗氧化、抗炎等多种生物活性，即陈皮的保健功效增强，为陈皮越陈越佳的说法提供了科学依据。

4 结论

随着陈皮贮藏时间的延长，其总黄酮含量显著增加，抗氧化能力增强，橙皮苷、川陈皮素和桔皮素3种主要的黄酮类物质含量递增。这一变化规律可为阐释陈皮“陈久者良”的科学内涵提供理论依据，对研究陈皮陈化品质的形成及其调控具有参考价值。

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（責任编辑  罗 丽）