植物覆盖对蕉园土壤质量和微生物多样性的影响

徐胜涛 王攀磊 何翔 魏加弟 张莉 王美存 王永芬 杨佩文 俞艳春 郑泗军

摘要：【目的】研究植物覆盖对蕉园土壤养分、酶活性、微生物多样性和功能微生物的影响，明确植物覆盖改善蕉园土壤质量的效果，为植物覆盖在香蕉可持续性生产中的应用提供理论依据和技术支持。【方法】以传统种植方式（裸露土壤）为对照，以自然生杂草和种植豆科植物大翼豆[Macroptilium atropurpureum（DC.） Urb.]为植物覆盖处理， 分析植物覆盖对云南省蕉园土壤质量和和微生物多样性的影响。【结果】植物覆盖可有效提升蕉园非根际土壤的有机质和碱解氮含量，自然生杂草和豆科植物覆盖处理分别较裸露土壤对照显著增加24.80%～39.62%和31.63%～89.54%（P<0.05，下同），但对根际土壤的理化性质影响较小。植物覆盖显著影响根际和非根际土壤的酶活性，与裸露土壤对照相比，自然生杂草和豆科植物覆盖处理的根际土壤蔗糖酶和磷酸酶活性分别增加40.32%～52.92%和9.21%～43.10%，土壤过氧化氢酶活性下降5.88%～26.94%;非根际土壤的蔗糖酶、脲酶和磷酸酶活性分别增加26.82%～114.98%、19.85%～65.77%和22.52%～33.82%;与香蕉定植前相比，植物覆盖明显提升了根际土壤的蔗糖酶和脲酶活性，显著提升了非根际土壤的蔗糖酶和过氧化氢酶活性。植物覆盖影响根际和非根际土壤的微生物多样性指数，与香蕉定植前相比，蕉园土壤微生物多样性指数总体上呈下降趋势;植物覆盖显著影响非根际土壤的碳氮功能拷贝数，与裸露土壤对照相比，固碳微生物（cbbL-R）、固氮微生物（nifH）、氨氧化古菌（amoA-A）和氨氧化细菌（amoA-B）的碳氮功能基因拷贝数分别增加55.97%～69.28%、39.60%～46.36%、16.52%～379.39%和23.98%～48.15%，但对根际土壤的影响较小。【结论】植物覆盖能有效提升蕉园土壤质量，特别是非根际土壤的微生物多样性指数和碳氮功能基因拷贝数等指标，而对根际土壤影响较小。不同覆盖处理中，豆科植物覆盖效果优于自然生杂草覆盖。

关键词： 植物覆盖;香蕉;土壤质量;土壤微生物多样性;碳氮功能基因

0 引言

【研究意义】在香蕉生产过程中，为避免杂草与香蕉的水肥竞争，蕉农通常会去除杂草，因此造成长期的地表裸露，同时过量施用化肥造成土壤酸化和板结，直接导致蕉园土壤出现不同程度的退化，降低了蕉园的生产力，严重影响香蕉产业的可持续发展（Zhong et al.，2014;Ahumuza et al.，2015）。土壤退化是制约农业生产的主要限制因素之一，特别是土壤裸露造成的土壤水分和养分流失，严重制约了农业生产的可持续性、高效性、高产性和优质性（Qu et al.，2014;Wu et al.，2014）。植物覆盖作为一种有效的保护性耕作方式，能改善土壤质量，提高作物对养分的吸收和利用。因此，研究植物覆盖对蕉园土壤质量及微生物多样性的影响，对香蕉产业的发展及土壤的健康可持续利用均具有重要意义。【前人研究进展】已有研究表明，植物覆盖能改善土壤结构，含蓄水分和养分，增加土壤有机质含量和碳活性物质，促进微生物的生长和繁殖（Kim et al.，2013;Nascente et al.，2013），进而促进土壤养分的良性代谢循环，增加土壤中可被作物利用的养分（Piotrowska and Wilczewski，2012）。香蕉套種咖啡能有效改善园地环境，降低病虫害发生，提高资源利用率，达到提质增效的效果（范国明，2003）;秋植香蕉和辣椒复合生产模式通过对辣椒的根系腐烂和茎叶回田，有效改善土壤结构，增加土壤养分，促进香蕉苗生长，提高香蕉产量（柯开文等，2012）;秋植蕉园套种大白菜能增加复种指数，改变蕉园单一作物群体，减少病虫害发生，抑制和减少杂草的危害（黄继庆等，2012）;蕉园套种魔芋可实现资源共享、效益双赢，为蕉农增产增收（李进波等，2015）;蕉园套种韭菜可显著提高土壤酶活性和微生物数量，对香蕉枯萎病有明显的抑制效果（赵明等，2015）;蕉园套种红薯配合复合菌肥能显著促进香蕉生长，改善土壤根际生态，抑制香蕉枯萎病的发生（汪军等，2019）。以上研究均表明，蕉园套种其他作物，有利于增加蕉园土壤的生物多样性，可在一定程度上提高土壤质量，同时提高蕉园的经济效益。【本研究切入点】植物覆盖作为一种保护性耕作措施，能有效提升土壤质量，特别是在杂草防控、涵养土壤水分和养分、控制水土流失等方面的作用效果显著，已逐渐显示出其对农业可持续生产的重要性（Mbuthia et al.，2015;Chocano et al.，2016）。但由于与传统种植模式的理念相悖，现阶段针对植物覆盖在香蕉生产中应用的研究较少。【拟解决的关键问题】拟通过定位试验，研究植物覆盖对蕉园土壤养分、酶活性、微生物多样性和功能微生物的影响，明确植物覆盖改善蕉园土壤质量的效果，以期为覆盖植物在香蕉可持续性生产中的应用提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验地概况及试验材料

试验区位于云南省保山市潞江镇云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所科技示范园内（东经98°53′14″，北纬24°57′58″），海拔约700 m，年平均气温21.3 ℃，全年基本无霜，绝对最高气温40.4 ℃，绝对最低气温0.2 ℃，≥10 ℃活动积温7800 ℃，年日照时数2333.7 h，年降水量750 mm，年蒸发量2100 mm，相对湿度70%，属于亚热带干热河谷气候类型。土壤属砂壤土，试验地土壤、气候条件和土壤类型均能满足香蕉正常生长。香蕉品种选择该试验区主栽品种云蕉1号，在该地区生长周期约1年。

1. 2 试验方法

试验以传统种植方式（裸露土壤）为对照（CK），以自然生杂草覆盖（Natural weed，NW）和人工种植豆科植物大翼豆[Macroptilium atropurpureum（DC.）Urb.]覆盖（Cover plant，CP）为植物覆盖处理。自然生杂草在生长前期保持在30 cm高度，避免前期杂草遮蔽香蕉，影响香蕉生长;人工种植大翼豆为典型覆盖植物，具有良好的固土和增加土壤氮素作用，且适应性较强（李树云等，1996），可在该试验区种植，但在香蕉生长前期，需保证60%以上的覆盖度才能达到覆盖效果。试验设4次重复，随机区组排列。香蕉苗采取宽窄行种植，宽行行距3.5 m，窄行行距1.5 m，香蕉苗在窄行上采取“之”字形种植，株距2.0 m，小区面积100.0 m2，每小区定植香蕉苗40株，具体种植方式参照图1。2017年7月定植香蕉苗，香蕉栽培和水肥管理参照当地香蕉种植模式。

1. 3 测定项目及方法

1. 3. 1 土壤理化性质 以S形沿小区对角线采集土壤样品，分为根际和非根际土壤，根际土壤为香蕉假茎周围30 cm内的土壤，非根际土壤为宽行种植覆盖植物的土壤。采样时间为2017年7月和2018年7月，取样深度为0～30 cm。土壤样品一部分自然风干，过75目筛后备用;一部分-80 ℃冷冻干燥除去水分后-80 ℃保存，用于土壤微生物多样性和功能微生物定量分析。土壤pH采用pH计（水∶土=2.5∶1）测定，有机质含量采用重铬酸钾外加热法测定，碱解氮含量采用碱解扩散法测定，速效磷含量采用碳酸氢钠—钼锑抗比色法测定，速效钾含量采用醋酸铵—火焰光度计法测定。

1. 3. 2 土壤酶活性 土壤过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定;土壤蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定;土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定，根据土壤pH，分别采用碱性和酸性测定方法;土壤脲酶活性采用靛酚蓝比色法测定。

1. 3. 3 土壤微生物多样性 DNA提取：用OMEGA土壤DNA提取试剂盒提取土壤微生物总DNA，提取方法参照操作说明。每份土样3个重复。采用NanoDrop 2000分光光度计和0.8%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的质量、浓度及完整性。

PCR扩增：以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物，New England Biolabs公司的Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer及高效和高保真的酶进行PCR扩增，确保扩增效率和准确性。引物对应区域：16S V4区引物为515F/806R，515F：5'-GTG CCAGCMGCCGCGGTAA-3'，806R：5'-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3';真菌ITS rRNA基因扩增引物为ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

PCR擴增产物混样和纯化：根据PCR扩增产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用2.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，使用Thermo Scientific公司的GeneJET胶回收试剂盒回收产物。

文库构建和上机测序：使用New England Biolabs公司的NEB Next? UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经Qubit定量和文库检测合格后，委托上海派森诺生物科技有限公司采用Illumina MiSeq高通量测序平台进行测序分析。

1. 3. 4 土壤微生物功能基因定量分析 碳氮功能微生物绝对定量：以土壤微生物总DNA为模板，PCR扩增固碳微生物（cbbL-R）、固氮微生物（nifH）、氨氧化古菌（amoA-A）和氨氧化细菌（amoA-B）的特异性基因片段，并克隆到pMD-18T载体上，挑选阳性克隆进行扩大培养并委托上海派森诺基因科技有限公司测序;所得序列在NCBI数据库中进行序列同源性分析。抽提经测序鉴定为阳性克隆的质粒，用紫外分光光度计测定其DNA浓度，按公式换算成拷贝数，制成标准品。具体计算公式为：拷贝数（copy number/μL）=6.02×1023（copy number/mol）×质粒浓度（ng/μL）×10-9/[（载体分子量+插入片段分子量）×660]（g/mol）。引物对应区域为：固碳微生物（cbbL-R）F：5'-AAGG AYGACGAGAACATC-3'，R：5'-TGCAGSATCATGT CRTT-3'，270 bp;固氮微生物（nifH）F：5'-ACCCGCC TGATCCTGCACGCCAAGG-3'，R：5'-ACGATGTA GATTTCCTGGGCCTTGTT-3'，280 bp;氨氧化细菌（amoA-B）F：5'-CTGGGGTTTCTACTGGTGGTC-3'，R：5'-GCAGTGATCATCCAGTTGCG-3'，100 bp;氨氧化古菌（amoA-A）F：5'-ATAGAGCCTCAAGTAG GAAAGTTCTA-3'，R：5'-CCAAGCGGCCATCCAG CTGTATGTCC-3'，100 bp。将标准品稀释后作为模板在荧光定量PCR仪[TIB8600，泰普生物科学（中国）有限公司]上进行扩增，建立质粒拷贝数浓度与Ct间的定量标准曲线和线性回归方程。通过荧光定量PCR检测各处理DNA样品的Ct，然后计算出特异性基因片段拷贝数目。具体操作方法参照Walker（2001）的反应体系及扩增程序。

1. 4 统计分析

试验数据均采用Tukey HSD检验不同处理间的差异显著性，数据差异性采用R语言进行相应的分析，以Sigmaplot 10.0制图。

2 结果分析

2. 1 植物覆盖对蕉园土壤理化性质的影响

由表1可知，与CK相比，植物覆盖处理根际土壤的pH显著降低（P<0.05，下同），有效磷含量明显增加，其他理化性质基本无显著变化（P>0.05）;植物覆盖能有效增加非根际土壤的有机质和碱解氮含量， NW和CP处理的非根际土壤有机质含量分别显著增加24.85%和39.72%，碱解氮含量显著增加31.62%和89.52%。与香蕉定植前的土壤相比，种植香蕉后根际土壤pH和有机质呈明显下降趋势，降幅分别为11.18%～21.46%和25.09%～34.16%，但电导率、碱解氮、有效磷和有效钾含量呈明显上升趋势，升幅分别为31.86%～35.40%、81.59%～87.78%、61.09%～111.75%和73.42%～85.45%;非根际土壤有机质、有效磷和有效钾含量下降明显，降幅分别为19.81%～42.61%、6.10%～30.39%和24.97%～37.20%，电导率明显增加，增幅为36.28%～53.98%。

2. 2 植物覆盖对蕉园土壤酶活性的影响

由图2可看出，植物覆盖对蕉园不同类型土壤的蔗糖酶、过氧化氢酶、脲酶和磷酸酶活性均有不同程度的影响，植物覆盖不同处理的酶活性在根际土壤和非根际土壤间存在明显差异。在根际土壤中，植物覆盖处理对土壤蔗糖酶、过氧化氢酶和磷酸酶活性影响明显，对土壤脲酶活性影响不明显，与CK相比，NW和CP处理的根际土壤蔗糖酶活性分别增加40.32%和52.92%，土壤磷酸酶活性分别增加43.10%和9.21%，土壤过氧化氢酶活性则下降26.94%和5.88%;在非根际土壤中，与CK相比，NW和CP处理的土壤蔗糖酶活性分别增加26.82%和114.98%，脲酶活性分别增加19.85%和65.77%，土壤磷酸酶活性分别增加22.52%和33.82%。与香蕉定植前相比，植物覆盖处理明显提升了根际土壤蔗糖酶和脲酶活性，对非根际土壤蔗糖酶和过氧化氢酶活性也有明显提升作用。由此可见，植物覆盖能有效影响根际和非根际土壤的酶活性，而这些酶参与土壤中的碳氮代谢循环和生理生化反应，说明植物覆盖能有效改善土壤的养分循环，与植物覆盖能显著影响土壤有机质和碱解氮含量的结果具有良好的一致性。

2. 3 植物覆盖对蕉园土壤微生物多样性指数的影响

对于微生物群落而言，不同的指数对于衡量群落多样性的侧重点各不相同，常用的度量指数主要包括侧重于体现群落丰富度的Chao1和ACE指数，以及兼顾群落均匀度的Shannon和Simpson指数。由表2可知，植物覆盖对根际和非根际土壤的微生物多样性指数影响存在明显差异，对土壤真菌和细菌的多样性指数影响效果也存在一定差异。植物覆盖显著影响了根际土壤真菌的ACE和Shannon指数，与CK相比有所降低;植物覆盖也显著影响非根际土壤真菌的Chao1和ACE指数，与根际土壤不同，CP处理非根际土壤真菌的Chao1和ACE指数较CK呈显著提升趋势，但NW处理较CK均有不同程度的降低。与香蕉定植前的土壤相比，根际和非根际土壤的真菌多样性指数，除CP处理非根际土壤外，均呈下降趋势。植物覆盖后的土壤细菌多样性指数与真菌多样性指数存在一定差异，植物覆盖处理显著影响根際土壤细菌的Chao1、ACE和Shannon指数，与CK相比，根际土壤的细菌多样性指数整体上呈下降趋势，而对非根际土壤的细菌多样性指数影响不显著;与定植前的土壤相比，根际和非根际土壤的细菌多样性指数，除CP处理非根际土壤外，其他植物覆盖处理均出现一定程度的下降趋势，与土壤真菌多样性指数有较好的一致性，说明种植香蕉后的蕉园土壤微生物，无论真菌还是细菌，微生物多样性指数均出现下降，可能与香蕉生产中化肥施用较多，造成土壤不同程度的退化有关。

2. 4 植物覆盖对蕉园土壤碳氮功能基因拷贝数的影响

土壤碳氮功能微生物参与土壤的碳氮代谢循环，体现了可利用碳氮的再生产能力，直接反映了土壤生产力的潜力。由图3可看出，植物覆盖处理对根际和非根际土壤中的cbbL-R、nifH、amoA-A和amoA-B等功能基因拷贝数有明显影响，尤其是对非根际土壤的碳氮功能基因拷贝数影响显著，与CK相比，NW和CP处理的cbbL-R基因拷贝数分别增加55.97%和69.28%，nifH基因拷贝数分别增加39.60%和46.36%，amoA-A基因拷贝数分别增加16.52%和379.39%，amoA-B基因拷贝分别增加23.98%和48.15%;但对根际土壤的碳氮功能基因拷贝数影响效果有限。与香蕉定植前的土壤相比，蕉园根际和非根际土壤的nifH基因和amoA-B基因拷贝数均呈一定程度的上升趋势，但蕉园非根际土壤的cbbL-R基因和amoA-A基因拷贝数呈一定程度的下降趋势。

2. 5 植物覆盖蕉园不同类型土壤指标的主成分分析结果

根据土壤的理化性质、酶活性及碳氮功能基因等指标，对不同土壤类型、根际和非根际植物覆盖处理进行主成分分析。由图4-A可知，蕉园根际和非根际土壤区域的土壤指标能被明显区分开，第一主成分（PC1）的贡献率为56.68%，第二主成分（PC2）的贡献率为18.22%，前2个主成分累计解释变量方差的74.90%。在非根际土壤中，植物覆盖明显影响土壤pH、nifH基因和过氧化氢酶活性，而对根际土壤的影响主要集中在土壤碱解氮、有效磷、有效钾、amoA-A基因和cbbL-R基因等。由图4-B可知，植物覆盖处理非根际土壤指标的主成分分析能有效区分不同处理，特别是CK和CP处理差异明显，PC1的贡献率为57.32%，PC2的贡献率为18.14%，前2个主成分累计解释变量方差的75.46%。由图4-C可知，植物覆盖处理根际土壤指标的主成分分析各处理重合度较高，不能进行有效区分，PC1的贡献率为31.76%，PC2的贡献率为21.93%，前2个主成分累计解释变量方差的53.69%。通过不同土壤类型、根际和非根际植物覆盖处理的土壤指标主成分分析可知，植物覆盖主要影响非根际土壤，对根际土壤影响较小，但非根际土壤由于覆盖植物的功能存在一定差异，导致其在不同土壤指标上主成分分析有明显差异。

3 讨论

绿色植物覆盖已逐渐成为现代果业生态可持续生产的重要方式（Farzanian et al.，2010）。本研究结果表明，植物覆盖能有效改善非根际土壤理化性质，显著提升非根际土壤部分种类酶活性和碳氮功能基因拷贝数，同时蕉园非根际土壤真菌Chao1和ACE多样性指数均出现一定程度的上升趋势，与Qian等（2015）、沈鹏飞等（2019）认为覆盖措施能有效提升苹果园土壤理化性质、酶活性和微生物群落的研究结果一致，也与杨亚东等（2017）研究认为豆科植物间作能有效提升土壤理化性质和固氮基因拷贝数的结果相似，充分说明本研究中的植物覆盖能有效提升蕉园的土壤理化质量，可作为蕉园土壤可持续利用的重要栽培措施。根际土壤中的电导率、碱解氮、有效磷和有效钾含量的明显上升，主要与香蕉种植过程中大量施用化肥有关。而自然生杂草和豆科植物覆盖处理较裸露土壤可有效增加非根际土壤的有机质和碱解氮含量，其原因在于植物覆盖能有效增加土壤的碳氮源，自然生杂草能有效增加土壤碳源，豆科植物能有效增加土壤氮源，因此植物覆盖处理有效提升了土壤的有机质和碱解氮含量。同时，植物覆盖有效提升了蕉园非根际土壤pH、微生物多样性和功能微生物的基因拷贝数，说明植物覆盖可有效改善蕉园非根际土壤生产潜力，依托于本研究的宽窄行设计，可为香蕉与植物覆盖的休闲轮作栽培模式提供潜在可行的技术方案。

本研究发现，不同植物覆盖处理间存在一定差异，相对于裸露土壤，自然生杂草和豆科植物覆盖处理均能有效提升土壤理化指标和微生物多样性，但两者在提升土壤的质量上存在一定差异，自然生杂草处理中为牛筋草[Eleusine indica（L.） Gaertn.]，是一种禾本科杂草，具存在一定固碳作用，但与作物有一定的水肥竞争，而豆科植物覆盖处理中种植的为大翼豆，是一种优良的豆科覆盖植物，具有固氮作用（董春华等，2016;张德和龙会英，2017）。本研究结果认为自然生杂草处理对有机质含量和固碳功能基因拷贝数影响明显，而豆科植物覆盖处理对固氮功能基因拷贝数影响明显，这些土壤相关指标结果与设置的不同覆盖处理直接相关。不同覆盖处理在非根际处理的土壤中差异明显，而在根际土壤中差异较小。总体来说，豆科植物覆盖处理对蕉园土壤质量的影响优于自然生杂草处理，且两个覆盖处理对土壤的影响显著优于裸露土壤对照。有研究认为覆盖植物与种植作物间确实存在水肥竞争情况，尤其是在水肥和光照竞争压力较大的生育期（刘小勇等，2014），但本研究表明在根际土壤中主要养分差异不明显，说明在根际土壤中，覆盖处理对香蕉的水肥竞争较小，但在非根际土壤中养分有一定的差异，说明覆盖主要提升蕉园的非根际土壤质量，而对根际土壤的影响较小。本研究仅从土壤的理化指标、酶活性、微生物多样性指数和碳氮功能基因拷贝数等方面探析植物覆盖对蕉园土壤质量的影响，对整个蕉园生态系统的影响尚有待进一步系统研究。

植物覆盖能有效提升果园土壤的水肥涵养能力，降低地表温度，有效促进果树作物的生长，进而提升产量和品质（曹铨等，2016;温美娟等，2016;白岗栓等，2018）;也能降低马铃薯和南瓜等作物的病害（Everts，2002;Larkin et al.，2010），同时增加农田生态系统的多样性，降低作物虫害的发生程度（Erenstein，2003;Gardiner et al.，2009）。本研究仅从土壤质量的角度对不同处理和土壤类型进行比较，未对土壤的温度、水分和品质进行监测，通过对土壤相关指标的研究，表明植物覆盖对土壤质量有提升作用。但本研究覆蓋年限仅为一年，其对香蕉产量和品质及对不同病害的影响程度和规律也有待进一步研究。

4 结论

植物覆盖能有效提升蕉园土壤质量，特别是非根际土壤的微生物多样性指数和碳氮功能基因拷贝数等指标，而对根际土壤影响较小。不同覆盖处理中，豆科植物覆盖效果优于自然生杂草覆盖。

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（責任编辑 王 晖）