宫颈癌术前联合重组人p53腺病毒注射液及放射治疗的有效性

李雪梅， 郑丽娥， 王金华， 何春妮

宫颈癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤之一，在全球女性恶性肿瘤中，宫颈癌仅次于乳腺癌，位居第二位，每年新增病例约为50万[1]。人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是宫颈癌发生的主要病因，但是感染HPV的妇女只有少数会进展为宫颈癌，还有其他的因素共同参与宫颈癌的发展过程，p53基因可能是其中一个最值得关注的因素。HPV病毒癌基因E6及E7编码的蛋白可介导P53蛋白的降解和酶失活，并能封闭P53诱导的细胞调节蛋白功能，解除细胞增殖抑制，故HPV16或HPV18感染的宫颈癌细胞中抑癌基因p53表达的蛋白浓度常较低[2]。

宫颈癌的治疗方式根据患者的一般情况及临床分期来选择，生物治疗作为恶性肿瘤的第四种治疗模式现蓬勃发展，其中的基因治疗因具有靶向性，可针对疾病异常基因，在改善宫颈癌的治疗现状、有效治疗肿瘤、提高患者的生存质量以及保留年轻患者的生育功能方面有着重大的意义。世界上首个基因治疗药物重组人p53腺病毒注射液(recombinant adenovirus-p53，rhAd-p53注射液)，是由5型腺病毒为载体和人p53肿瘤抑制基因重组，形成有活性的重组腺病毒颗粒，腺病毒可作为运载体把特定基因转移到细胞内[3]。现笔者收集2009年1月-2011年12月收治的宫颈癌患者50例，探讨rhAd-p53注射液联合放射治疗对宫颈癌患者的疗效，报告如下。

1 对象与方法

1.1对象 50例患者，年龄(44.8±6.8)岁(27～59岁)，取患者的宫颈手术标本蜡块进行研究。纳入标准：(1)年龄为18～80岁；(2)预计生存期至少6个月；(3)经病理证实的Ⅰb，Ⅱa及Ⅱb宫颈鳞状细胞癌初治患者；(4)具有临床易于观察和注射用药的可测量病灶；(5)美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)体力状况评分≤3；(6)血常规基本正常，无明显出凝血障碍；心肺肝肾功能基本正常。排除标准：(1)有远处转移(除腹腔及盆腔淋巴结转移)者；(2)治疗期间有其他抗肿瘤伴随治疗；(3)有无法控制的感染者；(4)有神经系统严重病变者；(5)出血倾向性疾病者；(6)妊娠和哺乳期女性；(7)有药物滥用史或酗酒者。本研究经医院伦理委员会批准，并按照自愿选择的原则进行分组，治疗前均签署知情同意书。

50例患者分为两组，其中基因治疗+放射治疗+手术组(GTRT组)20例，单纯放射治疗+手术组(RT组)30例。两组患者的年龄、临床分期、肿瘤大小、病理分级、淋巴结转移情况差别无统计学意义，具有很好的同质性和可比性(表1)。

1.2方法

1.2.1治疗方案 (1)RT组：近距离腔内后装放射治疗(192Ir)剂量为肿瘤边缘或穹窿部4 Gy，每次2 Gy，每周1次，共2次；2周后行宫颈癌根治术(广泛全子宫切除+盆腔淋巴结清扫)。(2)GTRT组：术前16 d瘤内注射rhAd-p53注射液(商品名今又生，深圳赛百诺基因技术有限公司)，剂量为每支1×1012VP，置于-20 ℃保存，使用时取出于室温下静置冻融，对直径≥4 cm的肿瘤，每支用生理盐水稀释至4 mL，对直径<4 cm的肿瘤每支稀释至2 mL，每次1支，肿瘤局部注射，于5 min内完成注射，每3天1支，连续5次；同时进行腔内后装放射治疗，同RT组，Ⅱb期及Ⅱb期以上的患者行全程外照射治疗，2周后行宫颈癌根治术。以上手术均由同一妇科肿瘤团队完成，术后宫颈局部病灶行组织病理及免疫组织化学分析。

表1 两组宫颈癌患者一般临床资料比较

Tab 1 Comparison of baseline characteristics between two groups of cervical cancer patients

临床指标GTRT组RT组n2030年龄范围/岁37～5927～57平均年龄/岁46.20±7.3643.87±6.44临床分期 Ⅰ期47 Ⅱ期1623 Ⅲ期00 Ⅳ期00病理分级 G125 G21318 G357淋巴结转移 是12 否1928

RT组：单纯放射治疗+手术组；GTRT组：基因治疗+放射治疗+手术组.

1.2.2检查方法 组织标本来源于术后行病理诊断的组织蜡块，石蜡切片机行4 μm厚连续切片。采用免疫组织化学法检测瘤灶组织中野生型P53，Bcl-2，Bax及Caspase-3蛋白的表达。鼠抗人P53单克隆抗体(Kit-0010，北京中杉生物技术公司)，免疫组织化学试剂盒(1684809)、即用型鼠抗人Bcl-2单克隆抗体(MAB-0014)、即用型鼠抗人Bax单克隆抗体(MAB-0254)、免疫组织化学MaxVision试剂盒(KIT-5010/5020/5030)(福州迈新生物技术开发有限公司)，参考说明书进行免疫组织化学检测。

1.2.3结果判断 免疫组织化学结果判断：每张切片随机观察10个高倍视野(×400)，每个视野计数200个细胞，统计阳性细胞数并观察显色度。阳性强度采用半定量法，按阳性细胞所占百分数评分：<10%为0分，10%～50%为1分，51%～75%为2分，>75%为3分。细胞不着色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分。二者分数相乘，0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，>4分为中强度阳性(++)。细胞凋亡情况以凋亡指数判断。疗效评价：短期疗效评价指标为安全性、生物学指标和组织分析；远期疗效评价指标为生存期。

1.2.4随访 采用门诊检查和电话联系相结合进行生存状况调查，时间截止于2017年10月。生存期为确诊日期至死亡或终止检查日期。GTRT组2例、RT组1例患者失访。

1.3统计学处理 采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，计量资料采用单因素方差分析，各组间比较经方差齐性检验；计数资料采用非参数检验。生存情况采用Kaplan-Meier相关分析。所有统计检验均采用双侧检验，P<0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1治疗后肿瘤病灶大小比较 rhAd-p53注射液及后装照射治疗后，GTRT组和RT组患者的宫颈局部肿瘤均明显缩小，平均缩小率分别为(90.73±7.36)%和(89.11±9.69)%，两组间差别无统计学意义(P>0.05，表2)。

表2 两组宫颈癌患者治疗前后肿瘤病灶平均缩小率比较

Tab 2 Comparison of tumor volume reduction between two groups of cervical cancer patients after treatment

分 组nV肿瘤/cm3术前术后平均缩小率/%GTRT组2016.59±7.941.55±1.4290.73±7.36RT组3012.34±7.041.22±0.9589.11±9.69

RT组：单纯放射治疗+手术组；GTRT组：基因治疗+放射治疗+手术组.

2.2生存情况比较 两组患者术后1年内生存率均为100%(GTRT组18/18，RT组29/29)；术后2年GTRT组生存率为90%(16/18)，RT组为75%(22/29)；术后≥5年的生存率GTRT组无明显变化，RT组继续下降至70%(20/29)，两组间比较差别有统计学意义(P<0.05)。

2.3TUNEL法检测结果 GTRT组和RT组均可见散在分布的棕黄色着色凋亡细胞，凋亡指数分别为(18.1±4.7)及(9.8±2.2)，组间比较差别有统计学意义(P<0.01，图1)。

2.4免疫组织化学检测结果 两组患者的P53及Caspase-3蛋白均可见染色，两组的凋亡相关蛋白P53，Caspase-3，Bcl-2及Bax的相对表达情况和量以及Bcl-2/Bax比值见图2和表3。

3 讨 论

3.1宫颈癌的治疗现状 宫颈癌的预后与临床分期、细胞学类型及转移情况密切相关，但大多数患者确诊时已是中晚期，对于局部肿瘤较大或已有微转移的中晚期年轻患者，为缩小瘤灶，降低临床分期，增加手术机会，保护卵巢功能及阴道，多在采取局部治疗(手术或放疗)之前给予新辅助化疗，但治疗过程极易产生毒副作用和耐药性，且因晚期宫颈癌和治疗后复发患者的免疫功能受到抑制，使得预后难以改善；部分早期的患者虽通过手术切除，但手术的创伤造成患者生活质量下降、生育功能丧失等。因此，探讨新的治疗策略势在必行。生物治疗作为恶性肿瘤新兴的治疗模式，近年来蓬勃发展，其中的基因治疗因具有靶向性，其治疗可针对肿瘤异常基因本身，而不损害周围正常组织。目前，肿瘤基因治疗的主要途径包括抑癌基因治疗、癌基因治疗、多药耐药基因治疗、免疫基因治疗、肿瘤血管基因治疗及药物敏感基因(自杀基因)治疗等[4]，其中最具有代表性的肿瘤基因治疗药物就是今又生。

3.2P53凋亡通路的相关蛋白 细胞凋亡是生物体内的一种主动的自我调控过程，包括内源性通路(线粒体依赖的凋亡途径)、外源性通路(死亡受体通路)及旁路途径等产生的级联放大反应，其发生的整个过程还受到多种调控基因的精细调控，其中p53基因促进细胞凋亡功能的研究已较为深入成熟。>50%的恶性肿瘤会出现p53基因突变，该基因与宫颈癌的发生有着极为密切的关系。目前普遍认为，p53基因突变与P53蛋白在组织中的表达是一致的。因此，采用免疫组织化学方法检测出的P53蛋白即为突变型P53蛋白[5]。p53调节与凋亡基因有关，有的调控编码细胞死亡受体蛋白，有的调节控制细胞线粒体完整性的Bcl-2凋亡家族。Bcl-2凋亡家族包括促进凋亡的Bax及抑制凋亡的Bcl-2[6]。bax的启动子存在p53结合位点，P53可直接作用于bax基因从而促进其转录，最终使Bax与Bcl-2结合并拮抗它的抗凋亡作用。在大多数情况下，p53还可以通过线粒体释放的细胞色素C来激活caspase途径从而诱导细胞凋亡。Caspase是一组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，一般认为Caspase-3是细胞凋亡过程中主要的终末剪切酶[7]。本研究结果显示，GTRT组经rhAd-p53注射液治疗后，宫颈癌灶组织P53蛋白表达量明显降低，与RT组比较，差别有统计学意义。GTRT组和RT组的宫颈癌灶组织的Bcl-2和Bax蛋白表达量均较少，而GTRT组的Bcl-2/Bax稍高于RT组。根据以往及同行的实验发现，在TUNEL染色、Bax/Bcl的Western及Caspase活性片段含量测定中，TUNEL染色和Caspase活性实验中的敏感性可达90%，且检测情况非常稳定，而Bcl-2及Bax的检测稳定性则较差[8]。此次Bcl-2，Bax及其比值的阴性结果可能与实验条件及过程有关系，也可能是转染进入细胞内的外源性p53基因没有激活下游抑癌基因bax表达，同时bcl-2表达也未见升高，不排除P53介导的宫颈癌细胞凋亡未经Bcl-2途径。本研究监测的Caspase-3蛋白表达量GTRT组较RT组明显升高。因大多数触发细胞凋亡最终均需通过Caspase-3介导的信号传导途径，故Caspase-3表达量明显提高也提示了细胞凋亡数量的增加。经过P53凋亡通路最终可导致细胞凋亡指数明显增多，本研究显示GTRT组凋亡指数较RT组明显升高。

表3 两组宫颈癌患者病灶中P53，Caspase-3，Bcl-2及Bax蛋白的表达

RT组：单纯放射治疗+手术组；GTRT组：基因治疗+放射治疗+手术组. 与GTRT组比较，☆：P<0.01.

3.3rhAd-p53注射液的临床疗效及在宫颈癌中的应用 本研究发现，两组宫颈癌患者治疗后局部肿瘤消退率均较高，说明rhAd-p53注射液对宫颈鳞癌的局部疗效确切，肉眼消退率高，术后1年累积生存率均较高，宫颈癌患者的总体预后均较好。从生存率来看，rhAd-p53注射液的远期治疗效果好。研究发现，rhAd-p53注射液治疗和放射治疗联合可抑制宫颈癌细胞的体外生长，可见这种联合治疗在提高宫颈癌的治疗疗效方面有一定的优势[9]。但对于宫颈鳞癌而言，其手术切除率较高，且大多数晚期患者放射治疗可获得较为明显的肿瘤局部消退率，且rhAd-p53注射液价格昂贵，使得其在宫颈鳞癌的应用受到极大限制。虽基因治疗仍有许多需要解决的问题，药物的临床使用也需要有更多的人群进行更长时间的随访，但基因治疗肿瘤必将成为未来医疗诊疗的趋势。

综上所述，宫颈鳞癌患者瘤内注射rhAd-p53注射液总体有效，与后装照射有协同作用，同时也可增强其抗癌效果，提高肿瘤局部消退率。但由于经费、方法及实验条件的限制，可能还需进行进一步研究加以验证。