原发性肝细胞癌患者血清抗p53抗体的检测及意义探讨

陈子若， 杨 庭， 余丽丽， 吴庆伟， 李亚东， 邱福南， 雷 棽， 黄 毅

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种恶性程度极高的肿瘤，由于起病较为隐匿且临床表现复杂多样，导致许多患者失去了最佳的治疗时机[1]。福建省为HCC高发省份，HCC死亡率在各类癌症居于首位[2]。目前临床上用于HCC的常规血清肿瘤标志物为抗原类标志物甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)。AFP检测对于HCC的及时诊断与治疗具有重要意义，但存在一定程度假阳性与假阴性的问题[3-4]。研究发现，在肿瘤发生发展时，由于机体免疫状态的变化，患者体内会产生针对自体肿瘤相关抗原(tumor associated antigens，TAAs)的免疫反应[5]，对TAAs信号起放大作用。因此，通过检测外周血抗TAAs抗体可以有效区分癌症患者与正常人，尤其有助于癌前阶段患者的发现[6]。

研究表明，p53在HCC患者血清存在针对p53的自身抗体，开展血清抗p53抗体的检测有助于HCC的诊断[7]。鉴于自身抗体在肿瘤诊断的明显优势，笔者拟通过构建的ELISA法与电化学发光法分别检测50例HCC患者、50例肝脏良性病变(liver benign lesions，LBL)患者、50例健康对照(healthy control，HC)的血清抗p53抗体及AFP，研究抗p53抗体单独检测以及与AFP联合检测对HCC的诊断性能，探讨抗p53抗体对HCC的诊断价值。

1 对象与方法

1.1对象 HCC组：收集2017年9月—2018年3月在笔者医院住院的HCC患者50例，男性36例，女性14例，年龄(51.2±11.6)岁(31～78岁)，均经过病理学和(或)病理细胞学确诊，采血前未接受过任何抗癌治疗。其中乙肝表面抗原阳性46例，阴性4例；肝硬化42例，无8例；肿瘤分化程度：低分化9例，中分化38例，高分化3例；肿瘤直径：<5 cm 27例，≥5 cm 23例；肝外转移：有11例，无39例。LBL组：同期诊治的LBL患者50例，男性39例，女性11例，年龄(54.3±13.6)岁(26～72岁)，包括血管瘤11例，肝炎20例，肝硬化19例。HC组来自笔者医院体检中心的健康体检成人50例，男性33例，女性17例，年龄(53.7±14.5)岁(27～75岁)。所有受试对象均采集空腹静脉血，离心分离出血清待测。

1.2方法

1.2.1构建间接ELISA法检测血清抗p53抗体 以0.5 ng/μL的 p53重组蛋白(酵母系统表达，带GST标签蛋白，美国约翰霍普金斯医学院高通量生物学中心提供)包被酶标孔板(美国Thermo Fisher Scientific公司)，100 μL/孔，4 ℃包被过夜；用含0.2%吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤3遍后，3%牛血清白蛋白(美国Amresco公司)300 μL/孔，37 ℃封闭1 h；PBST洗1遍后，加入1∶500稀释的血清样本，100 μL/孔，37 ℃温育1 h；PBST洗4遍后，加入1∶40 000稀释的HRP标记羊抗人IgG抗体(Jackson immuno公司)，100 μL/孔，37 ℃温育30 min；PBST洗4遍后，加入四甲基联苯胺(TMB)和3%过氧化氢(H2O2)(厦门英科新创公司)各50 μL，37 ℃避光显色10 min；加入2 mol/L硫酸(H2SO4)(厦门英科新创公司)50 μL终止显色，通过酶标仪(TECAN公司)在450 nm波长处测定每孔吸光度(OD)值。以“HC组检测OD均值+2倍标准差”作为抗p53抗体阳性判断的Cut-off值。

对构建的间接ELISA法进行批内与批间精密度的性能评估。批内精密度：低、高两种水平标本在同批次检测中重复测定20次，计算其批内CV。批间精密度：低、高两种水平标本每天复孔测定，连续测定20 d，计算其批间CV。

1.2.2AFP检测方法及其阳性判断 在罗氏cobas e602分析仪上采用电化学发光法检测各组血清AFP水平(AFP试剂盒购自德国罗氏公司)，操作严格按照试剂盒说明书进行。AFP阳性以>20 ng/mL为Cut-off值。

2 结 果

2.1间接ELISA法检测抗p53抗体的精密度评估 低、高两种水平标本检测的批内CV分别为7.21%和3.03%，均<10%；低、高两种水平标本检测的批间CV分别为10.16%和4.79%，均<15%。以上结果表明构建的间接ELISA法对抗p53抗体具有理想的检测精密度。

2.2血清抗p53抗体水平的比较 HCC组血清抗p53抗体水平明显高于LBL组(P<0.05)和HC组(P<0.01，图1)。

2.3血清抗p53抗体检测阳性率的比较 HCC组血清抗p53抗体阳性率为36.00%(18/50)，明显高于LBL组[16.00%(8/50)，(P<0.05)]与HC组[2.00%(1/50),(P<0.01)]。

2.4血清抗p53抗体、AFP单项及联合检测对HCC诊断敏感性、特异性、准确度的比较 抗p53抗体和AFP中有一项为阳性即视为联合检测阳性，以LBL组与HC组作为对照。结果显示，血清抗p53抗体、AFP单独检测对HCC诊断的敏感性分别为36.0%及54.0%，特异性分别为91.0%及83.0%；两者联合检测对HCC诊断的敏感性为76.0%(特异性80.0%)，明显高于抗p53抗体的敏感性36.0%(P<0.05，表1)。

表1 抗p53抗体、AFP单独检测及联合检测对HCC诊断效能的比较

Tab 1 The diagnostic performances of seperate and combinated detection of anti-p53 and AFP in HCC %

指 标敏感性特异性准确度抗p53抗体36.091.072.7AFP54.083.073.3抗p53抗体+AFP76.0△80.078.7

AFP:甲胎蛋白. 与抗p53抗体比较，△：P<0.05.

2.5ROC曲线分析血清抗p53抗体、AFP单独检测及联合检测对HCC的诊断价值 抗p53抗体、AFP单独检测对HCC诊断的AUC分别为0.630(95%CI0.547～0.707)和0.685(95%CI0.604～0.758)；两项指标联合检测对HCC诊断的AUC达0.770(95%CI0.694～0.835)(图2)。

3 讨 论

目前，HCC的诊断主要根据影像学、肝组织活检、血清学标志物。传统的超声、CT及MRI等影像学检查手段对病变体积微小的肝癌如小肝癌(≤1 cm)容易漏检，存在难以避免的盲区。肝组织活检结果准确可靠，但是取样受限较多，患者常常不易接受。相比而言，血清学检测具有无创、操作简便的优势，且在影像学发现之前，血清学标志物常有异常表达，可以对肿瘤起到监测和预警的作用。目前临床应用的血清肿瘤标志物均为抗原类标志物，其中以AFP在HCC的应用最为广泛，但其诊断的特异性与敏感性均有待改善，表现为约1/3慢性肝病、肝纤维化以及肝硬化患者可出现血清AFP水平不同程度的升高，而在HCC患者中AFP阴性或低浓度的比例达1/3，容易导致HCC患者的漏诊[8]。近年来的研究表明，TAAs相关自身抗体的检测有望为肿瘤的诊断开辟出一条新途径[9]。在疾病发展早期TAAs水平较低不能被常规方法所检测到时，机体免疫系统就能识别并产生针对TAAs的大量抗体，因此与抗原类标志物检测相比，TAAs相关自身抗体在肿瘤的早期具有更高的敏感性；其次，产生的TAAs相关自身抗体半衰期长，能稳定存在于血清中相当长的一段时间，易于临床检测[10]。

作为一种公认的抑癌基因，p53参与细胞周期、凋亡、衰老、DNA修复等多种细胞功能的调节[11-12]，在多种肿瘤(包括HCC)中存在突变、过表达等方面的异常改变[13]。针对p53的血清自身抗体与HCC的关系已经引发了关注。胡德海等开展的一项研究表明血清抗p53抗体在HCC患者的血清中存在高表达，敏感性达39.1%(18/46)[14]。国外学者报道，抗p53抗体在非乙非丙型HCC患者血清中的阳性率高达91.52%(特异性84.63%)，且与AFP含量、肿瘤大小、疾病分期、MELD积分、Child-Pugh积分之间呈正相关[15]。以上研究结果表明，血清抗p53抗体的检测有助于HCC的诊断，是否抗p53抗体与AFP的联合检测有助于提高对HCC的诊断效能值得探讨。

本研究通过构建的ELISA法与电化学发光法分别检测50例HCC、50例LBL、50例HC的血清抗p53抗体与AFP，研究抗p53抗体单独检测以及与AFP联合检测对HCC的诊断性能，结果显示，HCC组血清抗p53抗体和AFP的水平均明显高于LBL组(P<0.05)和HC组(P<0.01)，其中抗p53抗体对HCC的敏感性为36.0%，特异性为91.0%，AUC为0.630(95%CI0.547～0.707)；AFP对HCC的诊断敏感性为54.0%，特异性为83.0%，AUC为0.685(95%CI0.604～0.758)。将抗p53抗体与AFP联合检测，可将对HCC的敏感性明显提高至76.0%(特异性80.0%)，AUC提高至0.770(95%CI0.694～0.835)。以上研究结果表明，抗p53抗体对HCC具有理想的诊断价值；抗p53抗体与AFP具有互补性，两者的联合检测有助于进一步提高对HCC的诊断效能(在保证特异性的前提下，提高敏感性)。鉴于本研究尚属小样本的研究，抗p53抗体与AFP联合检测在改进HCC患者的血清学筛查质量的临床价值和意义还有待后续大样本、多中心的进一步验证。