斑马鱼心脏损伤模型的建立及桔梗提取物对其心脏损伤的干预作用研究

史有阳 郝 炜 吴春宇 韩向晖 杨 瑞 孙霃平 刘 胜

（1.上海中医药大学附属龙华医院中西医结合乳腺科，上海200032；2.上海中医药大学中医外科研究所，上海200032）

阿霉素是蒽环类广谱抗肿瘤药物，临床上广泛用于治疗恶性肿瘤，具有高效、广谱的特点，但其多种毒副反应特别是心脏毒性使其在临床应用上受到限制[1]。课题组前期临床研究表明，中药桔梗能够改善乳腺癌患者阿霉素化疗后心脏毒性，提高患者心脏射血功能[2]。本实验选用心脏特异表达绿色荧光转基因Tg（cmlc2：EGFP）斑马鱼，借助荧光显微镜可以全程观察其心脏发育及血液流动状况[3-4]。通过不同浓度的阿霉素干预，建立阿霉素诱导的斑马鱼心脏损伤模型，并进一步观察桔梗提取物对阿霉素诱导的斑马鱼心脏损伤的干预作用。

1 实验材料

1.1 实验动物 心脏特异表达绿色荧光转基因Tg（cmlc2：EGFP）斑马鱼由上海中医药大学附属龙华医院斑马鱼实验平台提供，实验全程遵循斑马鱼实验平台实验动物福利与伦理要求，研究通过动物伦理委员会批准。实验前一晚将成年雌雄斑马鱼按1∶2 配对，放入带隔板的产卵盒中，第2 天早晨抽掉隔板。产卵完成1 h后，用吸管将鱼卵收集于含有胚胎培养液的无菌培养皿中，清洗鱼卵数次除去未受精卵、粪便等杂物，将发育完整的受精卵放于28.5 ℃的培养箱中培养48 h，每24 h换液1次。

1.2 药品、试剂与仪器 阿霉素（购自碧云天生物技术有限公司，货号SC0159）；中药桔梗饮片（购自上海养和堂饮片有限公司，批号171012）；木犀草素（购自成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-17102605）；普 通 倒 置 显 微 镜（SMZ745，Nikon）；荧光倒置显微镜（SMZ18，Nikon）；微量电子分析天平（BAS224S，德国Startotius）；安捷伦Agilent 1260 Infinity液 相 色 谱 仪（美 国Agilent）；N-1300D-WB型旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）。

2 实验方法

2.1 药物制备 称取桔梗饮片10.0 g，加入120 mL 70%乙醇溶液浸泡4 h后回流提取1 h，过滤，收集滤液。重复2 次后合并滤液，旋转蒸发浓缩至1 g/mL，过0.45 μm微孔滤膜，收集滤液，-20 ℃分装保存，用时稀释至所需浓度。同时，通过高效液相色谱（HPLC）检测，测定桔梗提取物中木犀草素含量为2.85 mg/g，符合质量标准，色图谱见图1。

图1 桔梗提取物高效液相色谱图

2.2 阿霉素诱导斑马鱼心脏损伤模型的建立 选取发育正常，受精后48 h的斑马鱼20 条，放置于24孔板中，随机分为4 组，分别为正常组和阿霉素低、中、高 剂 量（5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）组，每组5 条。各组斑马鱼放入28.5 ℃的培养箱中，分别加入含不同浓度阿霉素的胚胎培养液，正常组加入不含阿霉素的胚胎培养液，培养24 h。普通倒置显微镜观察各组斑马鱼心脏形态，计算生存率。将各组斑马鱼放于4%甲基纤维素中，摆放于侧卧位，荧光倒置显微镜下观察，记录心率，测量静脉窦-动脉球（SV-BA）距离。最终选择合适浓度的阿霉素，以建立斑马鱼心脏损伤模型。

2.3 斑马鱼对桔梗提取物的耐受试验 选取160条状态良好，受精后48 h的斑马鱼放入24孔板中，随机分为8组，每组20条。采用等比浓度梯度稀释法，用胚胎培养液稀释桔梗提取物至20、40、80、160、320、640、1 280 μg/mL，以空白培养液为对照组。加药完成后放入28.5 ℃培养箱中培养24 h，显微镜下观察斑马鱼的生存情况，计算生存率。

2.4 桔梗提取物对阿霉素诱导的斑马鱼心脏损伤的影响 选取25条发育正常，受精后48 h的斑马鱼放入24孔板中，随机分为5组，分别为正常组、模型组和桔梗提取物低（20 μg/mL）、中（40 μg/mL）、高（80 μg/mL）剂量组，每组5条。除正常组外，其余各组斑马鱼使用阿霉素制作心脏损伤模型。造模后分别予相应浓度的桔梗提取物干预24 h，使用普通倒置显微镜观察各组斑马鱼心脏形态，使用荧光倒置显微镜观察斑马鱼心脏收缩和舒张形态，记录和计算各项心脏功能指标，包括心率、SV-BA距离、每搏输出量、心输出量。

2.5 统计学方法 运用SPSS 21.0软件进行统计学分析，实验数据以（±s）表示，组间比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 斑马鱼心脏损伤模型制作中阿霉素用量 经低、中、高剂量（5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）阿霉素及不使用阿霉素作用24 h，斑马鱼生存率均为100%。正常组斑马鱼活动力强，无心包水肿；中、高剂量阿霉素干预24 h后，斑马鱼活动力受到抑制，心房、心室逐渐变大，出现不同程度的心包水肿，其中高剂量阿霉素组斑马鱼心包水肿尤为严重。见图2。与正常组斑马鱼相比，中、高剂量阿霉素组斑马鱼心率明显下降（P＜0.05）、SV-BA距离显著增大（P＜0.05），见表1。考虑10 μmol/L阿霉素毒性适中，故后续实验选取10 μmol/L阿霉素诱导斑马鱼心脏损伤，建立心脏损伤模型。

图2 阿霉素干预后各组斑马鱼心包及心脏表型比较

3.2 桔梗提取物对斑马鱼的安全剂量 桔梗提取物1 280 μg/mL组斑马鱼全部死亡，640、320、160、80、40、20 μg/mL组 斑 马鱼存活率分别为90.0%、100.0%、1 0 0.0%、1 0 0.0%、1 0 0.0%、100.0%。斑马鱼对桔梗提取物的最大耐受剂量为320 μg/mL。因此，在安全剂量范围内选择20、40、80 μg/mL这3个浓度进行后续实验。

3.3 桔梗提取物对阿霉素诱导的斑马鱼心脏损伤的影响 与正常组比较，模型组斑马鱼心包出现水肿；与模型组比较，中、高剂量桔梗提取物干预24 h后，斑马鱼心包水肿减轻。见图3。与正常组比较，模型组斑马鱼心率明显降低（P＜0.05），SV-BA距离增大（P＜0.05），每搏输出量、心输出量均显著降低（P＜0.05）。经中、高剂量桔梗提取物干预24 h，斑马鱼心率较模型组明显增加（P＜0.05），SV-BA距离变短（P＜0.05），每搏输出量、心输出量均有效提高（P＜0.05）。见表2。

4 讨论

斑马鱼（zebrafish），个体长约3～4 cm，具有繁殖速度快，喂养简单，容易大规模饲养的特点。斑马鱼作为新型模式动物的优势正在逐渐被人们认识，其基因与人类基因的相似度达87%[5]。近年来斑马鱼模型已广泛用于中药毒性成分、有效物质筛选及药物代谢研究[6]。斑马鱼早期胚胎透明，发育24 h时即可出现心跳，发育48 h时心脏已形成并具有完整功能，借助显微镜可以方便观察药物对心脏的毒性作用。

桔梗味苦、辛，性平，归肺经，具有宣肺、祛痰、利咽、排脓的功效。《神农本草经》记载，桔梗“主胸胁痛如刀刺，腹满肠鸣幽幽，惊恐悸气”[7]。现代药理研究也发现，桔梗及其有效活性物质具有心脏保护[8]、抗肿瘤[9-10]、抗炎[11]、预防缺血再灌注损伤的功效[12]。YU等[13]发现桔梗内活性成分木犀草素具有预防心肌缺血再灌注损伤的作用，其机制可能与降低心肌细胞氧化应激水平，减少活性氧生成，抑制线粒体凋亡信号通路激活途径有关。LIN等[14]研究表明，桔梗提取物可通过抑制IGF-IIR表达从而逆转血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡。

表1 不同浓度阿霉素干预后斑马鱼心脏功能比较（x-±s）

图3 各组斑马鱼心包及心脏表型比较

表2 各组斑马鱼心脏功能比较（x-±s）

本研究选用心脏特异表达绿色荧光的转基因（cmlc2：EGFP）斑马鱼作为实验动物，通过观察斑马鱼心脏表型，测量SV-BA距离，计算心率、每搏输出量、心输出量等心脏指标进行整体毒性评估。静脉窦和动脉球之间的距离可反映心房和心室的位置变化。我们发现10、20 μmol/L阿霉素诱导24 h后，斑马鱼活动能力受限，SV-BA距离增大，心房、心室较正常组明显变大，出现不同程度的心包水肿，心率出现下降。实验结果证实，10 μmol/L阿霉素能够建立斑马鱼心脏损伤模型。每搏输出量及心输出量是衡量心脏功能强弱的重要指标，心输出量的降低是心力衰竭的重要临床指征[15]。本研究结果表明，40、80 μg/mL桔梗提取物干预24 h后，心脏损伤模型斑马鱼心包水肿消失，每搏输出量及心输出量均有所提高，心功能得到显著改善，阿霉素诱导的心脏损伤得到了抑制。

综上所述，桔梗提取物在保护阿霉素诱导的斑马鱼心脏损伤方面有一定的效果，但其具体分子机制以及信号通路还有待进一步研究。