补肾活血汤改善膝骨关节炎大鼠行为学的实验研究∗

汤小康 杨 华 刘慧英 周长征 卢 敏 唐成剑

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

骨性关节炎（OA）是一种以关节软骨退变和丢失为主要病理特征的疾病，是中老年人群中的常见病、多发病［1］。中医理论认为，OA属“骨痹”范畴，多因机体“肝肾亏虚，风寒湿邪杂至”，致使人体“气滞血瘀、经络痹阻”，为“本虚标实、虚实夹杂”之证［2］。补肾活血汤方药出自《伤科补要》，长于补气血、强筋骨，其在OA的治疗上有着较普遍的运用［3］。本实验用补肾活血汤对膝骨性关节炎（KOA）大鼠进行治疗干预，并收集分析相关行为学数据，为评估补肾活血汤治疗KOA疗效提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级6周龄SD雄性大鼠18只，体质量（150±20）g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2016-0002。实验前在湖南中医药大学第一附属医院实验中心适应性饲养7 d，每笼3只，空气相对湿度维持在30%～40%，室温维持在21～23℃，常规标准颗粒饲料及饮用水饲养。观察7 d，所有动物无疾病及异常后开始实验。

1.2 实验药物

补肾活血汤：熟地黄、破故纸、菟丝子各15 g，杜仲、枸杞子、归尾、山茱萸肉、肉苁蓉、没药、独活各9 g，红花6 g。水煎，每剂200 mL，生药含量约为0.57 g/mL，由湖南中医药大学第一附属医院中药制剂室提供。

1.3 分组与造模

将SD大鼠随机分为补肾活血汤组、模型组及空白组，每组6只，每只大鼠常规称体质量并记录。补肾活血汤组和模型组大鼠常规碘伏与酒精交替消毒腹部和双膝关节，无菌条件下10%水合氯醛腹腔给药麻醉，双膝关节腔注射4%的木瓜蛋白酶0.2 mL，隔日注射1次，连续注射2周。空白组大鼠仅常规碘伏与酒精交替消毒腹部，无菌条件下水合氯醛腹腔给药麻醉，隔日注射1次，连续注射2周。补肾活血汤组、模型组及空白组大鼠均置于相同饲养环境的标准饲养笼中饲养。

1.4 给药方法

造模成功后，按人-鼠换算出服药量为10.31 mg/（kg·d），补肾活血汤组灌胃补肾活血汤，每天2次。模型组和空白组灌胃蒸馏水。连续给药4周。

1.5 观察指标

1.5.1 一般情况 连续2周造模给药结束后，观察各组大鼠的精神状态、体质量、膝关节活动度等。

1.5.2 小动物活体双膝关节活体成像 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，运用X线片收集各组大鼠双膝关节影像学图像，观察双膝关节面间隙狭窄、关节面磨损及变形、骨赘生成等情况。

1.5.3 自主活动次数测定 采用大鼠自主活动程序测定仪观察各组大鼠的自发活动次数。设定测定程序后，将大鼠置入测定箱中，适应3 min后，计算机记录每只大鼠3 min和5 min内活动次数以评估其活动度。

1.5.4 旷场实验 给药结束后，于上午8∶00～12∶00时间段内进行实验，每只大鼠测定1次，每次10 min。握住SD大鼠尾部1/3处，将其轻轻置入旷场箱中心区域内，开启计时、录像，记录各组SD大鼠的平均速度和运动总长度以评估其活动度。

1.5.5 水迷宫实验 在同一水迷宫实验室内，连续训练4 d，每天训练1次，若大鼠2 min内未找到高出水面2 cm站台，则将其抓放至站台上停留20 s。连续训练4 d后进行正式测试，记录各组大鼠找到平台时间和活动距离以评估其活动度。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较

见表1。适应性喂养7 d，造模前补肾活血汤组、模型组和空白组大鼠精神状态一致，无明显萎靡、反应迟钝，双膝关节无明显肿胀、活动不利，各组体质量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。造模后2周，补肾活血汤组、模型组大鼠较空白组精神萎靡、反应迟钝，双膝关节可见肿胀、活动不利；各组体质量比较，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组大鼠体质量比较（g，±s）

表1 各组大鼠体质量比较（g，±s）

与空白组造模后比较，∗P＜0.05

补肾活血汤组模型组空白组6 6 6 194.00±8.60 195.33±10.23 194.50±8.47 206.83±8.37*202.50±13.37*245.33±7.63

2.2 各组大鼠造模后双膝关节活体成像比较

造模2周后，各组大鼠双膝关节影像学图像显示：补肾活血汤组和模型组大鼠双膝关节面间隙狭窄、关节面磨损、变形及骨赘生成较空白组大鼠双膝明显。见图1～图3。

2.3 各组大鼠自主活动次数比较

见表2。补肾活血汤组、空白组大鼠3 min、5 min内自主活动次数均多于模型组大鼠（P＜0.05）。

2.4 各组大鼠旷场实验结果比较

见表3。补肾活血汤组、空白组大鼠10 min活动总距离大于模型组大鼠（P＜0.05）。补肾活血汤组、空白组大鼠10 min活动平均速度大于模型组大鼠（P＜0.05）。

图1 补肾活血汤组双膝关节X线片

图2 模型组双膝关节X线片

图3 空白组双膝关节X线片

表2 各组大鼠自主活动次数比较（次，±s）

表2 各组大鼠自主活动次数比较（次，±s）

与模型组比较，△P＜0.05。下同

组别补肾活血汤组模型组空白组n 6 6 6 3 min内65.50±10.56△41.17±6.11 67.67±4.97△5 min内109.00±8.25△62.50±9.42 118.33±5.72△

表3 各组大鼠旷场实验结果比较（±s）

表3 各组大鼠旷场实验结果比较（±s）

组别补肾活血汤组模型组空白组n 6 6 6活动总距离（cm）13 396.50±699.32△10 572.67±683.68 16 436.83±716.62△平均速度（cm/s）22.32±1.76△17.62±1.14 27.39±1.19△

2.5 各组大鼠水迷宫实验结果比较

见表4。补肾活血汤组、空白组大鼠找到平台时间和活动距离均短于模型组大鼠（P＜0.05）。

表4 各组大鼠水迷宫实验结果比较（±s）

表4 各组大鼠水迷宫实验结果比较（±s）

组别补肾活血汤组模型组空白组n 6 6 6找到平台时间（s）30.17±6.27△46.83±5.98 19.00±2.37△活动距离（cm）1 330.17±128.99△1 741.83±116.95 1 076.33±106.99△

3 讨论

OA发病往往导致患者生活质量不同程度的下降，膝关节是OA发病的常见部位［4］。随着我国人口老龄化程度逐渐上升，KOA已严重影响人民的健康［5］。因KOA发病机制复杂，理想的KOA动物模型是研究其发病机制、危险因素及治疗方法等的重要手段。实验动物关节腔给药诱发KOA方法，具有操作简单、创伤小、成功率高及更接近人KOA病理过程等特点，可用于观察KOA早期病理改变及研究药物对骨关节病变的影响［6-7］。本研究采用4%的木瓜蛋白酶大鼠双膝关节腔注射，隔日注射1次，连续注射2周。造模后较空白组大鼠精神萎靡、反应迟钝，双膝关节可见肿胀、活动不利，体质量显著低于空白组大鼠，X线片影像学显示造模大鼠双膝关节面间隙狭窄、关节面磨损变形及骨赘生成较空白组大鼠明显。结果说明木瓜蛋白酶膝关节腔注射法能为KOA发病机理及干预措施研究提供良好动物模型［8-9］。

补肾活血汤中君药为熟地黄和山茱萸肉，具有补益肝肾、气血的功效；臣药为破故纸、菟丝子、杜仲、枸杞子和肉苁蓉，有强筋壮骨的功效；归尾、没药、红花为佐药，可起到活血通络的功效；引药为独活［10］。诸药配伍，共奏补肾活血之效，使肝肾精气充足，气通血畅，以达行气、活血、化瘀之功，肾虚血瘀从源头解决，诸证得除［11］，在退行性OA的治疗中取得了不错的疗效［12-13］。现有研究表明，补肾活血汤具有抑滑膜细胞产生白细胞介素-1β和基质金属蛋白酶-1的功效［14］，补肾活血汤含药血清能有效促进体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化［15-16］。自主活动次数、旷场实验和水迷宫实验是评估大鼠行为学的重要实验方法，KOA患者往往表现出主动性活动减少、生活被动等症状。在本实验中与模型组大鼠自主活动次数减少、旷场实验10 min活动总距离和平均速度降低及水迷宫实验找到平台时间和活动距离延长等行为学表现相似，补肾活血汤组大鼠各项行为学指标均优于模型组，说明补肾活血汤具有改善膝骨关节炎大鼠行为学指标，治疗KOA的功效。