女贞子提取物干预大鼠膝骨关节炎的实验研究∗

陈春雯 严 波 单乐天 王春雷 周 莉△

（1.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053；2.浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院，浙江杭州 310000；3.浙江省肿瘤医院，浙江 杭州 310022）

骨关节炎（OA）是临床常见的关节疾病，有15%～40%的60岁及以上人群受其影响［1-2］。随着人口老龄化的加剧和肥胖率的上升，OA的患病率逐年增加［3］。女贞子是木樨科植物女贞子的干燥成熟果实，最初记录于《神农本草经》，主要用于治疗骨质疏松症、关节炎和骨痛等年龄相关的疾病［4-5］。在中医学中，女贞子被认为是具有补肾活血的可食用草本植物，可有效治疗腰膝酸软［6］。根据中医的理论和临床经验，肾虚与骨关节疾病发病有关，补肾活血可促进骨代谢和形态的发生［7］。许多补肾活血的中药已经临床用于治疗OA，取得了积极的效果［8-9］。有研究表明，滋阴补肾法代表方二至丸（由女贞子和墨旱莲2味中药组成）通过调节雌二醇（E2）和C反应蛋白（CRP）的表达，能改善软骨细胞功能，减轻滑膜炎症，从而改善绝经后膝骨关节炎（KOA）的症状，将可能开辟治疗KOA的有效新途径［10］。本研究通过动物实验观察女贞子提取物对KOA病变中疼痛和软骨损伤的影响，初步对其作用机制进行探究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠32只，体质量180～220 g，上海斯莱克实验动物有限公司提供，浙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（浙）2013-0016。

1.2 药物及试剂

女贞子（浙江天道医药有限公司，批号17072201），称取女贞子粉末100 g置于1 000 mL的圆底烧瓶中，加入10倍量的纯水浸泡30 min，加热回流提取60 min，滤过收集煎液，向残渣加入8倍量的纯水，再加热回流提取60 min，滤过，合并2次煎液，真空减压浓缩至1 g/mL，即得女贞子水提液，水提液以5 000 r/min离心10 min，取上清液冷冻干燥成粉末备用。戊巴比妥钠粉剂（中国医药集团上海化学试剂公司）。0.9%氯化钠注射液（中国大冢制药有限公司，批号5G70J3）、番红O染色液（美国Sigma公司）、4%多聚甲醛溶液（中国Solarbio公司）、乙二胺四乙酸（EDTA）（中国Solarbio公司）、碘乙酸盐（MIA）（美国Sigma公司）、Ⅱ型胶原酶（美国Worthington）、IMDM培养液（美国Gibco公司）、0.25%EDTA-胰蛋白酶（美国Gibco公司）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）粉末（Sigma公司，美国）、二甲亚砜（DMSO）溶液（美国Sigma公司）、胎牛血清（FBS）（美国Gibco BRL，Grand Island，NY）、PBS（美国Phosphate Buffered Saline，Gibco公司）、柠檬酸钠缓冲液（中国北京市中衫金桥生物技术有限公司）、中性树胶封片剂（中国北京博奥森生物技术有限公司）、Triton X-100（美国Sigma-Aldrich公司）、SYBR荧光定量试剂盒（中国Takara公司）、反转录试剂盒（中国Takara公司）、山羊血清（中国Solarbio公司）、4%多聚甲醛（中国Solarbio公司）、引物（中国上海市生工生物工程股份有限公司）、抗体（美国Danvers，MA）。

1.3 实验仪器

倒置YLS-3E电子压痛测定仪（中国安合盟天津科技发展有限公司）、DK-S12型恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）、SW-CJ-1F层流超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、AXiovert200荧光倒置显微镜（BX20）（日本Olympus公司）、全自动多功能酶标仪（美国BioTek公司）、二氧化碳细胞培养箱（3111）（美国Thermo公司）。

1.4 分组与造模

32只SD大鼠称体质量后随机分组、编号，分为正常组、模型组、女贞子灌胃组、女贞子注射组，每组8只。大鼠膝骨关节炎疼痛模型采用碘乙酸关节腔注射造模法。对正常组大鼠双侧后肢膝关节腔内各注射50 μL 0.9%氯化注射液，其他组大鼠均通过向双侧后肢膝关节腔内注射50 μL MIA（30 mg/mL），建立大鼠KOA疼痛模型［11］。

1.5 干预方法

造模成功后，女贞子灌胃组采用女贞子提取物3.5 g/kg［10］灌胃处理，女贞子注射组采用关节腔内注射给药方式，向大鼠膝关节腔注射50 μL女贞子提取物（100 μg/mL），正常组和模型组大鼠双侧后肢膝关节腔内各注射50 μL 0.9%氯化注射液。治疗持续4周，于末次给药后1周测定行为学数据。治疗结束后，大鼠麻醉处死，进行膝关节取样。

1.6 大鼠软骨细胞提取

采用胶原酶和胰蛋白酶连续消化法分离3周龄SD大鼠（n=4）膝关节软骨细胞。将收集的软骨片切成1 mm3小块，用0.25%胰蛋白酶在37℃水浴锅内消化40 min，0.2%Ⅱ型胶原酶消化4 h。收集的细胞液用细胞筛（70 μm）过滤，离心弃上清。培养基（IMDM内添加10%胎牛血清和1%抗生素）重悬软骨细胞，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，每2日更换1次培养基。当软骨细胞达到80%融合后传代，备用。

1.7 指标测定

1.7.1 压痛测定 应用YLS-3E电子压痛仪测定大鼠的痛阈。将大鼠装入固定桶内，使其处于舒适又固定的状态，用扁形头对大鼠双侧后足背施压，当大鼠因疼痛出现鸣叫或挣扎时显示的压力值即为此大鼠的痛阈值。实验开始前测定基础痛阈，于造模后的第4周测定痛阈。

1.7.2 组织病理学分析 造模给药4周后，将大鼠麻醉处死，切取所有大鼠的膝关节，标记后在4%多聚甲醛中固定72 h，用10%EDTA脱钙液处理。连续处理8周后，进行脱水处理，包埋于石蜡中。切片后番红O染色，常规脱水、透明、封片，显微镜下观察、拍照。根据Mankin′s评分系统［12］，通过双盲观察在0～13的等级上进行评分分级。

1.7.3 免疫组织化学染色 取膝关节组织石蜡切片，烤片2 h，切片常规脱蜡至水后，分别加常规抗原修复液和骨组织抗原修复液进行抗原修复，然后用3%H2O2室温孵育30 min，用10%山羊血清封闭30 min，滴加TBS稀释的一抗Col2（1∶100），4 ℃孵育过夜，次日滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明、封片，显微镜下观察、拍照。

1.7.4 女贞子提取物对大鼠原代软骨细胞的影响 将细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板内，待细胞贴壁后进行给药处理。分别加入不同质量浓度（0、5、10、15、25、50、100、200 μg/mL）女贞子提取物，于培养箱中分别培养24 h和48 h后进行MTT活性检测。在避光环境中，向每个孔中加入10 μL MTT溶液（5.0 mg/mL）并在37℃孵育4 h。小心弃去孔内培养液，向每个孔中加入150 μL DMSO，置于摇床上低速振荡10 min，使紫色结晶物充分溶解。用酶标仪在490 nm处测量光密度值（OD），计算增殖率，增殖率（PR）=（女贞子处理的OD/未处理的OD）×100%。

1.7.5 Real-time PCR分析 将第2代大鼠原代软骨细胞消化计数后，以5×105个/皿均匀接种于6 cm的细胞培养皿中，培养24 h后，随机分为3组：对照组、TNF-α组、TNF-α+女贞子组。TNF-α组和TNF-α+女贞子组预先用TNF-α（10 ng/mL）处理6 h。TNF-α+女贞子组加入女贞子提取物（100 μg/mL），置于培养箱中培养24 h。提取细胞核酸后使用Nano Drop超微量分光光度计测定RNA浓度。根据TAKARA逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，采用SYBR反应体系进行Real-time PCR反应，每个样本设3个复孔，以Actin作内参，检测各组MMP13、Col10、Col2、Aggrecan的表达水平，目标基因序列见表1，各基因mRNA表达用2-ΔΔCt计算结果来表示。

表1 目标基因引物序列

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠行为学观察

见表2。模型组的压痛阈值较正常组显著下降（P＜0.01）；女贞子注射组与模型组比较有显著提高（P＜0.01）；女贞子灌胃组与模型组比较有所提高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠压痛阈值比较（g，±s）

表2 各组大鼠压痛阈值比较（g，±s）

与模型组比较，∗P＜0.01

正常组模型组女贞子灌胃组女贞子注射组8 8 8 8 266.60±26.99 255.00±41.01 240.50±16.39 255.30±19.69 279.13±19.29*108.88.±12.03 157.25±26.92 216.29±35.09*

2.2 各组大鼠膝关节软骨组织形态学观察

见图1。组织病理学结果显示，模型组的Mankin′s评分为（4.39±1.42）分，高于空白组的（1.23±1.01）（P＜0.01）；女贞子注射组Mankin′s评分为（1.77±0.73）分，较模型组显著下降（P＜0.01）；女贞子灌胃组（3.33±1.32）分，与模型组比较有所下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。女贞子注射组治疗后明显增加了软骨表面的软骨细胞数量，改善了软骨细胞排列和胶原质量。

2.3 各组大鼠膝关节软骨组织Col2观察

见图2。模型组软骨表达的Col2量少于正常组，女贞子灌胃和注射组的Col2表达趋于正常。

图1 各组大鼠膝关节软骨组织病理学观察（SO染色，比例尺=40 μm）

图2 各大鼠软骨中Col2表达的免疫组织化学观察（200倍）

2.4 各组大鼠膝关节软骨细胞活性比较

见表3。通过MTT法评估女贞子提取物对大鼠软骨细胞的增殖作用。剂量范围为5～200 μg/mL的女贞子提取物显著增加了软骨细胞的细胞活力，细胞增殖率在给药24 h后从0.6%增加到53.1%，48 h后从40.5%增加到78.0%。

表3 各组大鼠膝关节软骨细胞活性比较（%，±s）

表3 各组大鼠膝关节软骨细胞活性比较（%，±s）

女贞子质量浓度5 μg/mL 10 μg/mL 15 μg/mL 25 μg/mL 50 μg/mL 100 μg/mL 200 μg/mL给药后24 h 0.58±3.31 8.51±3.16 14.76±10.74 31.82±7.17 38.50±10.17 54.23±16.98 53.09±5.11给药后48 h 40.50±15.55 54.93±14.37 61.55±14.70 67.06±9.60 75.74±8.03 81.64±15.50 78.03±10.08

2.5 各组软骨细胞中OA相关基因表达水平比较

见表4。用TNF-α预处理软骨细胞以模拟OA病理状态。与正常组相比，TNF-α组显著上调Col10、MMP13的表达，下调Col2和Aggrecan的表达（P＜0.05或P＜0.01）。在女贞子处理24 h后，与TNF-α组相比，这些基因的异常表达向正常水平逆转（P＜0.05或P＜0.01）。

表4 各组软骨细胞中OA相关基因表达比较（±s）

表4 各组软骨细胞中OA相关基因表达比较（±s）

与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与TNF-α组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别正常组TNF-α组TNF-α+女贞子组Col10 mRNA 1.01±0.17 1.39±0.03##1.22±0.05#*Col2 mRNA 1.00±0.02 0.79±0.03##1.07±0.05##**Aggrecan mRNA 1.00±0.02 0.70±0.02##0.80±0.07##**Mmp13 mRNA 1.00±0.02 2.33±0.21##0.82±0.05##**

3 讨论

OA属于中医学“骨痹”范畴，本病发病多因肝血不足、肾元亏虚、血脉瘀滞，致骨失其所养，筋骨不坚，瘀血内阻或兼有外邪侵袭，经脉痹阻而致。中医药治疗OA的原则是补肾活血、强筋健骨、舒筋活络。临床中的辨证分型主要集中在风寒湿阻、气滞血瘀、痰瘀互结、痰湿阻络和肝肾亏虚等证型，在治疗上应采用补益肝肾、强腰健膝的中药。女贞子性凉，味甘、苦，归肝、肾经，具有滋补肝肾、明目乌发之功效，可用于治疗眩晕耳鸣、腰膝酸软、须发早白、目暗不明等症。现代药理实验表明，滋补肾阴中药能提高血清雌二醇水平，而雌激素水平降低与骨性关节炎的发生显著相关［10］。因此，女贞子具有被开发为抗骨关节炎药物的潜力。

局部关节内注射治疗是KOA保守治疗的代表方法。由于KOA病变仅存在于关节中，因此通过关节内注射途径施用的局部治疗是合适的策略。1951年，Hollander及其同事首次在关节炎中引入关节内注射治疗［13］，后来IA治疗被美国食品药品管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）批准。与常规口服给药相比，该技术避免了全身暴露和潜在的不良副作用。实际上，关节内注射具有许多内在特征，这可能比系统疗法更有优势：增加的生物利用度和安全性，更低的药物剂量和全身毒性，可避免的常规联合进入障碍和积极的安慰剂益处［14］。此外，它是一种相对简单且耐受性良好的程序，其恢复时间最短，可用作口服生物利用度低的药物的替代方式［15-16］。临床试验证明，IA疗法是KOA患者的一种替代和安全的治疗方法，与常规治疗相比，患者因不良事件而退出治疗的比例较低［17-18］。关节内注射是一种创新方式，可能有助于提高中医疗法的有效性和安全性。

研究发现关节腔注射云南白药，能通过抑制滑膜组织中降钙素基因相关肽（CGRP）阳性神经细胞的增生和巨噬细胞抗原（ED1）阳性炎症细胞数量，对KOA疼痛和炎症有明显的治疗作用［19］。研究发现通过膝关节关节腔注射凤凰衣水解物降低膝骨关节炎大鼠的炎症因子表达，提高关节软骨中蛋白多糖和Collagen-Ⅱ含量，对改善关节液炎症指标效果更好［20］。本实验通过比较女贞子提取物灌胃和关节腔注射治疗大鼠KOA，评估不同给药方式对女贞子抗OA作用的影响。结果表明，女贞子关节腔注射能明显减轻关节疼痛，而女贞子灌胃治疗对OA大鼠减轻疼痛的效果不如女贞子注射组。同样在大鼠软骨组织病理Mankin′s评分中，女贞子灌胃组和女贞子注射组低于模型组，女贞子注射组治疗效果优于女贞子灌胃组，女贞子提取物关节腔注射有明显的治疗效果。关节腔注射女贞子提取物直入靶点，作用明确，效果显著。

在本研究中，免疫组织化学分析显示女贞子的潜在机制与软骨中Col2表达的调节相关。以100 μg/mL的女贞子提取物进行体外实验评估，RT-PCR测定进一步阐明了女贞子不仅逆转了Mmp13、Col2和Col10的异常表达，还恢复了TNF-α处理的软骨细胞中Aggrecan的表达。本实验研究结果揭示了女贞子有抗OA作用，并阐明了与抑制软骨细胞肥大和分解代谢相关的分子机制。

只有一种动物模型不足以完全明确女贞子的药理学特征。因此，需要进一步的研究来验证女贞子对其他OA模型的抗OA作用。本研究尝试将关节内注射与中医治疗相结合，为补充传统治疗策略提供了另一种治疗方案。口服是中医治疗的传统途径。目前对关节内注射与口服之间差异的认识在中医药领域还很有限，需要更大规模的长期研究来获得更积极的结果，进一步证实关节内注射中药治疗的适用性。本实验通过RT-PCR分析评估女贞子对软骨细胞的体外作用，阐明了其与TNF-α处理的软骨细胞中Mmp13、Col2、Col10和Aggrecan的基因表达相关的机制，并未明确其具体信号通路，仍需要进一步的研究。