麻杏二三汤对COPD大鼠气道黏液高分泌MUC5AC、MUC5B表达的影响∗

邓秀娟 刘 雨 谭光波 谭宇军

（湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410100）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是呼吸系统常见的一种以气流阻塞为特征的慢性疾病，其发病率、致残率、死亡率较高，严重危害人类健康［1］。气道黏液高分泌是COPD重要病理生理特征之一，与COPD发生、发展、临床结局密切相关。研究发现，伴有慢性咳嗽、咯痰等气道黏液高分泌症状的人群，其罹患COPD的风险、气道阻塞程度、急性加重频率明显增加［2］。麻杏二三汤是临床治疗哮喘及COPD（痰浊阻肺证）有效验方，临床疗效显著，但其多局限于临床研究，在气道黏液高分泌机制研究中少见报道。本研究通过观察麻杏二三汤对COPD气道黏液高分泌大鼠模型肺组织气道酚红排泌量及黏蛋白MUC5AC、MUC5B表达的影响，探讨麻杏二三汤治疗COPD气道黏液高分泌的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠，36只，鼠龄10～12周，体质量（230±20）g，湖南省斯莱克实验动物中心提供［SYXK（湘）2016-0002］。

1.2 试药与仪器 麻杏二三汤方药组成：炙麻黄6 g，杏仁10 g，化橘红12 g，制半夏10 g，茯苓15 g，炒紫苏子10 g，莱菔子10 g，白芥子6 g，炙甘草6 g，生姜5～7片。中药饮片购自湖南省中医药研究院附属医院中心药房；一煎按生药量加入10倍水，煎煮1 h后保存药液，药渣再加入8倍量水，煎煮1 h，过滤，合并滤液浓缩成所需浓度。白沙烟（湖南中烟工业有限责任公司，焦油量15 mg/支，烟气烟碱量0.9 mg/支）；脂多糖（美国Sigma公司）；阿奇霉素分散片（石家庄四药有限公司）；PAS染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；逆转录试剂盒、UltraSYBR Mixture（北京康为世纪）；β-actin、MUC5AC、MUC5B引物（上海生工）；Tris、APS、SDS、TEMED、丙烯酰胺、甘氨酸（美国Sigma公司），RIPA裂解液（长沙维世尔生物试剂有限公司）；蛋白酶抑制剂（德国Merck）；小鼠MUC5AC、MUC5B单克隆抗体（美国SantaCruz公司）；HRP goat anti-rabbit IgG、HRP goat anti-mouse IgG（美国Proteintech公司）；Super ECL Plus超敏发光液（美国Thermo pierce公司）。自制有机玻璃熏烟箱（1.5 m×1 m×1 m大小，72 L）；切片机（莱卡，M199）；多功能显微镜和数字图像分析仪（Motic，BA410B）；-80℃冰箱（中科美菱，DW-HL388）；恒温水浴箱（河南金博，HH-S2）；台式冷冻离心机（eppendorf，TGL-18R）；摇床（江苏其林贝尔，TS-92）；电泳仪（美国 Bio-rad，164-5050）；转膜仪（北京六一，DYCZ-40A）；全自动凝胶成像分析系统（英国Syngene G公司）；荧光PCR板（Thermo，SPL0960）；荧光定量RCP仪（Thermo，PIKO REAL 96）。

1.3 分组与造模 SD雄性大鼠36只，采用随机数字表法分为正常组，模型组，阿奇霉素组，麻杏二三汤低、中、高剂量组，各6只。COPD气道黏液高分泌大鼠模型制作参考王俊［3］COPD模型制备。各造模组动物于第1、14日大鼠麻醉后气管内滴入LPS 200 μg；第2～28日给予大鼠每日2次香烟烟熏（每次15根，每次1 h）。

1.4 给药方法 大鼠给药剂量参考人和动物体表面积折算的等效剂量比率表，大鼠的等效剂量相当于人的6.3倍，每只动物每千克体质量给药量按临床人（70 kg）的等效量为中剂量，0.5倍等效量为低剂量，2倍等效量为高剂量。大鼠麻杏二三汤低剂量、中剂量、高剂量生药量分别为4.3、8.6、17.2 g/kg，阿奇霉素为22.5 mg/kg。给药体积按照10 mL/kg灌胃量予不同浓度麻杏二三汤及阿奇霉素灌胃，每日1次，模型组予等量0.9%氯化钠注射液。各组于末次给药后，禁食12 h，麻醉状态下处死动物，留取肺组织。肺组织固定于4%多聚甲醛行病理学检测，于液氮中行PCR、WB检测。

1.5 标本采集与检测 1）大鼠一般情况：观察大鼠体质量、活动状况、毛发、咳嗽、气喘及口鼻分泌物等。2）肺组织形态学观察：采用HE染色法。石蜡包块切片，二甲苯、乙醇脱蜡至水，苏木素浸染，盐酸乙醇分化，伊红溶液复染，再脱水透明封片，光镜下观察肺组织形态学改变。3）大鼠肺功能检测：大鼠麻醉后分离暴露气管，进行气管插管并固定，用小动物肺功能检测仪测定肺阻力（RI）和肺顺应性（Cdyn）。酚红排痰实验参考赵娜妹等［4］研究，大鼠腹腔注射7.05 mmol/L酚红溶液0.5 mL，0.5 h后处死分离气管，留取环状软骨至气管分叉处气管，0.5 mL 1 mol/L NaOH溶液反复冲洗3次，合并冲洗液注入比色管中，用721分光光度计（546 nm）测定光密度，根据酚红的标准曲线计算出酚红排泄量。4）肺组织MUC5AC、MUC5B蛋白表达：采用Western blotting法。RIPA裂解肺组织提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳，用湿转法将蛋白质转移至PVDF膜，脱脂奶粉封闭1 h，加入小鼠MUC5AC、MUC5B单克隆抗体（1∶200），β-actin（1∶5 000），4℃冰箱孵育过夜；孵育结束TBST洗3次后加入辣根过氧化物酶标记的鼠二抗和兔二抗（1∶5 000），室温下孵育1.5 h，充分洗涤后用ECL化学发光法显影，暗室曝光冲印，BioRad成像系统分析电泳条带，Quantity One图像分析软件计算3个基因与β-actin比值。5）肺组织MUC5AC、MUC5B基因表达：采用荧光定量RT-PCR法。取1 mL Trizol提取肺组织总RNA，1%变性琼脂糖凝胶鉴定，紫外分光光度计测定浓度及纯度，参照HiFiScript cDNA Synthesis Kit和UltraSYBR Mixture合成试剂盒进行两步法RT-PCR。以与内参β-actin mRNA的比值，作为目的基因mRNA的相对值。引物序列见表1。

表1 Real-time PCR引物序列

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0软件对结果进行统计学分析，所有数据以（±s）表示。符合正态性及方差齐性资料，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）；不满足正态性或方差齐性数据，采用非参数检验秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较 见表2。造模大鼠经烟熏及脂多糖处理后偶可闻及气道痰鸣音，毛发干枯，活动量减少，体质量较正常组明显下降（P＜0.01）。与模型组比较，第42日阿奇霉素组及中药中、高剂量组体质量明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各组大鼠体质量比较（g，±s）

表2 各组大鼠体质量比较（g，±s）

与模型组同时期比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与正常组同时期比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

组别正常组模型组阿奇霉素组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组n 6 6 6 6 6 6第1日249.40±13.51 248.80±14.06 250.80±14.06 251.50±13.45 250.10±12.01 252.70±14.73第28日455.20±34.28 358.40±41.97△△389.40±17.34△△374.40±19.11△△355.40±22.15△△382.60±24.81△△第42日532.20±29.52 403.60±17.49△△422.80±6.14△△*417.40±12.74△△425.00±17.56△△**454.20±11.65△△**

2.2 各组大鼠肺功能比较 见表3。与正常组比较，模型组大鼠Cdyn明显降低，RI明显增高（P＜0.01）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组及阿奇霉素组大鼠RI明显减低（P＜0.05）；中药高剂量组及阿奇霉素组Cdyn明显增加（P＜0.05）。

表3 各组大鼠肺功能比较［cmH2O/（mL·s），±s］

组别正常组模型组阿奇霉素组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组n6 6 6 6 6 6 RI 0.85±0.55 2.39±0.64△△1.41±0.81*1.54±0.48*1.51±0.35*1.36±0.88**Cdyn 0.61±0.17 0.28±0.07△△0.44±0.14*0.38±0.15△△0.40±0.11△△0.46±0.15*

2.3 各组大鼠肺组织形态学观察 见图1。空白组大鼠HE染色小气道黏膜上皮完整，管壁规整，无炎性细胞浸润，肺泡腔无病理性扩大。造模组大鼠HE染色可见大小不一的肺小泡形成，肺泡间隔破坏，小支气管扩张，气管上皮黏膜脱落，气管壁变型，管腔内痰黏潴留，管壁周围及肺间质可见淋巴细胞及中性粒细胞浸润。

2.4 各组大鼠气道酚红排泌量比较 见表4。与正常组比较，模型组大鼠气管酚红排泌量显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，阿奇霉素组及中药中、高剂量组大鼠气管酚红排泌量明显减少（P＜0.05或P＜0.01）。

图1 各组肺组织HE染色（肺泡及肺泡间隔，100倍；细支气管，400倍）

表4 各组大鼠气道酚红排泌量比较（μg/mL，±s）

表4 各组大鼠气道酚红排泌量比较（μg/mL，±s）

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2.5 各组大鼠肺组织MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA表达比较 见表5。与正常组比较，模型组大鼠肺组织MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA基因表达均明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，中药中、高剂量组及阿奇霉素组MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA基因表达明显降低（P＜0.05或P＜0.01），中药低剂量组MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA表达呈下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表5 各组大鼠肺组织MUC5AC、MUC5B基因表达比较（±s）

表5 各组大鼠肺组织MUC5AC、MUC5B基因表达比较（±s）

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2.6 各组大鼠肺组织MUC5AC、MUC5B蛋白表达比较 见表6。与正常组比较，模型组肺组织黏蛋白MUC5AC、MUC5B蛋白表达均明显增加（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组比较，阿奇霉素组及中药高剂量组MUC5AC、MUC5B表达显著下降（P＜0.05），中药中剂量组MUC5B蛋白明显降低（P＜0.05）。

表6 各组大鼠肺组织MUC5AC、MUC5B蛋白表达比较（±s）

表6 各组大鼠肺组织MUC5AC、MUC5B蛋白表达比较（±s）

组别正常组模型组阿奇霉素组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组n 6 6 6 6 6 6 MUC5AC 0.14±0.04 0.24±0.09△0.14±0.05*0.23±0.08 0.19±0.05 0.14±0.12*MUC5B 0.16±0.07 0.29±0.06△△0.17±0.06**0.24±0.03△0.21±0.04*0.17±0.07**

图2 各组大鼠肺组织MUC5AC、MUC5B蛋白相对含量

3 讨论

气道黏液高分泌是COPD重要病理生理特征之一，慢性黏液高分泌与COPD患者FEV1的加速下降和住院时间的增加密切相关［5］。气道黏液由气管、支气管分泌，是杯状细胞分泌的黏蛋白及黏膜下腺体分泌的水、糖类、蛋白质、脂类及矿物质的混合物，黏蛋白虽然仅占气道黏液的2%，黏蛋白糖基组成的变化却是引起黏液理化特性改变的主要原因。在成人呼吸道分泌的黏蛋白中，MUC5AC和MUC5B是主要分泌物，气道黏液高分泌过程中MUC5AC和MUC5B表达明显升高，尤以MUC5AC异常升高为主［6］。

COPD属于中医学“喘证”“咳嗽”范畴，中医学认为“痰饮”贯穿其发生、发展始终，气道黏液高分泌可能就是中医学之“痰饮”。麻杏二三汤出自焦树徳教授，其组方由二陈汤、三子养亲汤加麻黄、杏仁而成，方中二陈汤理气健脾，燥湿化痰，为治一切痰饮之通剂。三子养亲汤之白芥子温肺利气化痰、莱菔子下气消痰定喘、苏子降气止咳平喘，三药合用降逆化痰平喘。配伍麻黄宣肺平喘，杏仁降气平喘，宣降有度，全方共奏健脾燥湿、降气止咳平喘之功。临床治疗肺源性心脏病、慢性支气管炎、哮喘、COPD属痰浊阻肺证疗效显著［7-11］。

本研究采用烟熏联合脂多糖建立大鼠COPD模型，模型组大鼠肺功能肺阻力明显增加，肺顺应性明显降低，病理学符合COPD慢性支气管炎及肺气肿病理改变，气道酚红排泌量明显增多，提示构建的模型符合COPD气道黏液高分泌模型。与模型组比较，阿奇霉素组及中药中、高剂量组能明显降低气道酚红排泌量、黏蛋白MUC5AC、MUC5B基因及蛋白表达及肺阻力。结果提示麻杏二三汤能明显改善COPD大鼠肺功能，作用机理可能与减少气道黏液高分泌有关，其药效随着浓度增加而增强。临床及实验研究表明二陈汤及三子养亲汤均能通过抑制气道黏液高分泌延缓COPD和哮喘肺功能下降［12-14］。

本研究初步从气道黏液高分泌探讨了麻杏二三汤对COPD大鼠黏蛋白MUC5AC、MUC5B的影响，证实麻杏二三汤可通过抑制黏蛋白MUC5AC、MUC5B表达抑制气道黏液高分泌，为麻杏二三汤治疗痰浊阻肺之喘证提供了理论基础及临床指导。但气道黏液高分泌涉及炎症反应、氧化应激、蛋白酶失衡及胆碱能神经功能紊乱等多种病理生理机制，且黏蛋白分泌包括基因调节、蛋白合成及分泌释放全过程，因此，麻杏二三汤对黏蛋白分泌的调控机制有待进一步深入研究。