针刺捻转补泻手法对自发性高血压大鼠小脑GABA、Glu表达的影响∗

郝晓敏 梁靖蓉 曾天笑 孙 娇 袁静云 吴娇娟 张旭东 刘清国

（北京中医药大学，北京 100029）

据最新流行病学资料表明［1］，我国人群高血压病的患病率仍呈升高趋势，患者的知晓率、治疗率和控制率（粗率）总体仍处于较低的水平。高血压病作为一种严重危害人类健康的心脑血管疾病，其发病机制非常复杂。课题组前期研究发现，针刺可通过调节心、脑、肾等多个靶脑区的神经递质达到降压效果。小脑作为针刺捻转补泻降压所激活的靶脑区之一，除参与调节运动、肌紧张及维持身体平衡外，在调节心血管功能方面起重要作用。多项研究发现，电刺激小脑顶核可引起动脉压明显升高，小脑存在与心血管功能活动相关的神经元；针刺太冲穴被激活的脑区主要集中于小脑-后叶、扣带回、背侧丘脑和额叶联合皮层等［2］；针刺可通过调节小脑中去甲肾上腺素（NE）、5羟色胺（5-HT）、一氧化氮（NO）达到降压效果［3］，说明通过某些途径小脑会影响血压的变化。另有国内外诸多学者研究证实高血压动物中枢神经系统缺乏γ-氨基丁酸（GABA），中枢神经系统GABA的缺乏可能是引发高血压的一个因素［4］。还有研究显示［5］，针刺干预后血压的降低将会使谷氨酸（Glu）含量降低。GABA、Glu分别作为中枢神经系统内重要的抑制性神经递质和兴奋性神经递质之一，能够起到改善血压机制的作用［6］。本研究通过观察针刺捻转补泻手法对自发性高血压大鼠血压和小脑组织中GABA、Glu含量表达的影响，探讨针刺捻转补泻手法对小脑参与降压作用与调节中枢神经递质表达的关系，进一步验证捻转补泻手法的生物效应差异，促进高血压研究成果及时向临床转化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级自发性高血压大鼠（SHR）24只，Wistar-Kyoto（WKY）大鼠6只。所用大鼠均为雄性，9周龄，体质量（220±30）g，均购自北京维通利华实验动物养殖中心［动物许可证号：SCXK（京）2016-0006］。饲养于北京中医药大学动物室，饲养环境通风良好，定期紫外线消毒，室温22～23℃，湿度60%，自由进食及饮水。每日清扫动物粪便，更换垫料。由北京维通利华实验动物养殖中心提供标准实验用大鼠饲料。整个实验过程中对动物的各项处理均遵照中华人民共和国科技部2006年颁布的有关动物的使用及伦理学规定。本次实验动物保护与批准号：BUCM-4-2018061501-2058。

1.2 试剂与仪器 汉医牌针灸针（北京汉医医疗器械，规格0.25 mm×13 mm）。无创血压仪：BP-6（成都泰盟科技有限公司）。韩氏穴位针灸刺激仪：HANS-200E（南京济生医疗科技有限公司）。ELISA定量检测试剂盒：Rat GABA ELSIA KIT、Rat GLU ELSIA KIT（BG公司）。全自动多功能酶标仪（MULTISKAN MK3，Thermo，USA）。电热恒温培养箱：（DH4000A，天津泰斯特）。MINI shaker：（MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER）。自动洗板机：（thermo，USA）。

1.3 干预方法 将WKY大鼠6只作为空白组，SHR大鼠采用随机数字表法分为模型组、电针组、补法组、泻法组，每组6只。除空白组和模型组外，针刺各组均取“太冲穴”（双侧），取穴参照《实验针灸学》教材定位：于后肢足背1、2趾骨间凹陷处取“太冲穴”。各针刺组适应性喂养1周后，于每日下午将大鼠钻入自制鼠套中，固定于实验桌上，以右手为刺手，分别于双侧太冲穴直刺1～2 mm。电针组：进针后两侧太冲穴上的毫针分别连接韩式电针仪的正极与负极，刺激强度为电流强度1 mA，频率2 Hz，共留针20 min。补法组：大拇指作用力向前用力捻转，然后轻力向后退回，每次捻转幅度360°，每分钟60次，持续捻转3 min，共留针20 min。泻法组：大拇指作用力向后时用力捻转，然后轻力向前退回，每次捻转幅度360°，每分钟60次，持续捻转3 min，共留针20 min。针刺时让大鼠完全钻入鼠套内固定，以便于操作，所有针刺操作均由同一人完成，连续针刺14 d。空白组与模型组每日进行与各针刺组相同的抓捉固定刺激，不行针刺治疗。

1.4 血压测定 在室温（22±2）℃条件下，将清醒状态下的大鼠于36℃下预热（用温控器调节温度恒定）约15 min，用无创血压仪测量大鼠安静、清醒状态下尾动脉收缩压，连续测量3次，取其均值，避免噪音等外界环境刺激对血压的影响。于针刺第1、4、7、11、14日的上午固定时间段测量血压值，以减少误差。正式测压前训练若干次，每天测血压训练1次，连续3 d。注意：测压过程动作要轻柔，不能激惹大鼠，以免引起血压波动。加温时间不能过长，要固定在15 min；网套尺寸要合适，避免大鼠挣脱；尾套尺寸要合适，以免影响血压；室温要恒定，避免过高或过低对血压造成影响。

1.5 小脑中GABA、Glu含量测定 各组大鼠在麻醉状态下立即处死取材，各组先腹主动脉取血、断头摘取小脑组织，再经液氮冻存，后存放在-80℃冷冻室内。用ELISA法检测各组大鼠小脑组织中GABA、Glu的含量。具体操作严格按照试剂盒说明书执行。

1.6 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（±s）表示。多样本间均数比较采用单因素方差分析，继以LSD-t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠针刺治疗前后收缩压比较 见表1。与空白组比较，其他各组大鼠收缩压在针刺的第1、4、7、11、14日均具有显著差异（P＜0.01），表明SHR大鼠模型一直保持比较稳定的高血压状态。针刺治疗第1日，与模型组比较，各治疗组差异无统计学意义（P＞0.05）；3个治疗组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗第4日，与模型组比较，泻法组收缩压显著降低（P＜0.01），电针组次之（P＜0.05）。治疗第7日开始，与模型组比较，各针刺组收缩压均显著降低（P＜0.01）；与补法组比较，泻法组收缩压显著降低（P＜0.05）。治疗第11至14日，与补法组和电针组比较，泻法组收缩压均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），且第14日收缩压降低更显著（P＜0.01）；而补法组和电针组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠针刺治疗前后收缩压比较（mmHg，±s）

表1 各组大鼠针刺治疗前后收缩压比较（mmHg，±s）

与空白组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与电针组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与补法组比较，□P＜0.05，□□P＜0.01。下同

针刺第14日112.50±2.88 173.63±1.69**162.50±2.07**△△158.25±1.98**△△▲▲□□162.38±3.07**△△组别空白组模型组补法组泻法组电针组n 8 8 8 8 8针刺第1日110.38±2.33 165.13±1.46**164.63±2.07**164.50±1.77**164.75±1.67**针刺第4日111.88±1.46 165.50±1.07**164.25±0.89**163.25±1.67**△△163.75±2.55**△针刺第7日112.25±1.98 169.38±2.00**163.75±2.31**△△161.50±2.45**△△□163.50±2.00**△△针刺第11日112.38±2.97 172.00±2.73**163.13±1.55**△△160.50±1.77**△△□▲162.88±2.17**△△

2.2 各组大鼠小脑组织中GABA、Glu含量比较 见表2。针刺后与空白组比较，其他各组GABA表达水平显著降低（P＜0.01），Glu表达水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；GABA、Glu含量模型组与空白组比较有明显差异（P＜0.01）。与模型组比较，补法组、泻法组和电针组小脑组织中GABA含量显著升高（P＜0.01）；与补法组和电针组比较，泻法组大鼠小脑组织中GABA含量升高显著（P＜0.05或P＜0.01），而补法组和电针组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。Glu含量与模型组比较，3个治疗组均有显著差异（P＜0.05或P＜0.01）；与补法组、电针组比较，泻法组大鼠小脑组织中Glu含量明显降低（P＜0.05或P＜0.01），而补法组与电针组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠小脑组织中GABA、Glu含量比较（pg/mL，±s）

表2 各组大鼠小脑组织中GABA、Glu含量比较（pg/mL，±s）

组别空白组模型组补法组泻法组电针组n 6 6 6 6 6 GABA 123.57±8.78 81.22±6.67**96.95±6.58**△△110.99±8.64**△△▲□□100.24±5.96**△△Glu 2.62±0.47 4.27±0.11**3.76±0.40**△3.14±0.49*△△▲□□3.60±0.31**△△

3 讨论

高血压病作为严重危害人类身心健康的常见心血管病之一，是全球范围内的重大公共卫生问题，根据临床证候特点将其归为中医学“头痛”“眩晕”“肝风”等范畴。高血压病最常见的症状以肝系为主，主要证候类型为肝阳上亢和肝火炽盛，符合临床实际［7］。《素问·至真要大论篇》中指出“诸风掉眩，皆属于肝”，《千金方》中也指出“肝厥头痛，肝为厥逆，上亢头脑也”，都强调肝在本病发病中的重要性。前期文献统计表明，针灸治疗原发性高血压使用频次最高的为太冲穴［8］，作为足厥阴肝经原穴，是肝之原气经过和留止之处，有平肝潜阳、行气解郁、清肝养血的作用，对SHR大鼠降压效果最佳。故本课题选用太冲穴作为治疗穴。SHR是目前国际上公认的最接近人类原发性高血压的动物模型，已广泛应用于原发性高血压及抗高血压药物筛选的基础研究［9］。针刺作为一种非药物疗法，治疗高血压病见效快，操作简便且无明显不良反应，在临床得到了大力推广运用。小脑作为前期研究针刺捻转补泻手法所激活的靶脑区之一，体积仅占全脑10%左右，然而小脑神经元数量却占脑神经元总数的一半之多［10］，有研究发现小脑顶核内存在大量GABA能神经元［11］，Glu也是脑区中最重要且常见的兴奋性神经递质，主要分布于小脑等部位［12］。两者分别作为小脑内重要的抑制性神经递质和兴奋性神经递质之一，对血压的调控起重要的作用［13］。既往多项研究均表明，小脑对心血管活动具有重要调节作用［3，14-16］。近年不断的实验研究证实抑制性递质GABA与兴奋性递质Glu相互作用在高血压病等疾病中起着重要作用［15-16］。综上所述，血压与小脑中GABA和Glu关系密切，探索针刺对血压的调节效应及其与小脑内GABA、Glu的关系，将对阐明高血压的发病及治疗具有重要理论价值和临床意义。

针刺第1日，与空白组比较，模型组、补法组、泻法组和电针组血压差异显著，且血压较空白组均显著升高，说明SHR造模成功；与模型组相比，补法组、泻法组和电针组均无统计学差异，提示针刺第1日并未发挥明显降压效应。自针刺第4日开始，各治疗组逐渐开始发挥降压效应，且不同治疗组发挥降压效应时间与程度不同。针刺第4日，与模型组相比，泻法组与电针组首先开始发挥降压效应，且降压效果显著，但泻法组与电针组之间无统计学差异。针刺第7日，与模型组相比，补法组开始产生降压效果，即3个治疗组均发挥降压效应；与补法组相比，泻法组降压更显著。说明从第4日开始，针刺手法即开始发挥降压效应，泻法组与电针组比补法组起效时间早，且泻法组降压效果优于补法组。针刺第11日至第14日，与补法组和模型组比较，泻法组的降压效果更显著，且随着针刺时间的延长，泻法组表现出更明显的降压效果。但补法组与电针组之间比较并未见差异。以上结果表明，从针刺第4日开始，针刺手法即发挥降压效应，且泻法组降压效果最佳。补法组与电针组在降压程度方面未见统计学差异，但电针组起效时间要早于补法组，可能是电针组低频刺激，参数可控的特点导致。可见针刺手法可以显著降低SHR的血压，且泻法组效果最显著，与前期研究结果也一致，说明不同针刺手法存在效应上的差异性［3，17］。

GABA作为一种神经信号传导基质，广泛存在于哺乳动物大脑中，是神经中枢内主要的抑制性神经递质。研究资料表明［6］，GABA可以通过中枢神经系统达到降低血压、舒缓血管的作用，同时还具有镇静抗惊厥、调节大脑机能、加速新陈代谢及改善生殖生理等多种生物学功能［18］。GABA的降压机制主要是通过两种途径：一是抑制血管紧张素转化酶（ACE）活性，二是与脑内GABAA和GABAB受体结合起到扩张血管作用。GABA能改善动脉反射功能可能与其能与脑内受体结合改善血压的机制有关［19］。在PVN局部灌注GABA后，可见血压下降、心率减慢，表现为交感神经兴奋的抑制［20］，可见GABA对血压的调控具有重要作用且与小脑关系密切。本实验结果显示，与空白组相比，模型组小脑组织中GABA含量明显降低，表明SHR大鼠血压升高可能与小脑中GABA含量的降低有关。与模型组比较，补法组、泻法组和电针组均能显著升高GABA的含量；与补法组和电针组比较，泻法组升高GABA含量最显著。

Glu作为哺乳动物中枢神经系统中与血压变化最相关的兴奋性氨基酸递质［13］，主要分布于小脑等部位［12］。有研究表明，Glu是作用于脊髓中间外侧柱交感-肾上腺素能神经元的主要兴奋性递质，可引起交感心血管运动系统活动加强，使血压升高［21-22］。针刺可通过减少RV-LM核团中Asp、Glu的释放，减弱交感神经兴奋性，从而降低大鼠血压［13］。早期研究结果表明［23］，谷氨酸在血压调节的神经内分泌机制中亦起着主要作用。本实验结果显示，与空白组相比，模型组小脑组织中Glu含量明显升高，表明SHR大鼠血压升高可能与小脑中Glu含量的升高有关。与模型组比较，补法组、泻法组和电针组均能显著降低Glu的含量；与补法组和电针组比较，泻法组降低GABA含量最显著。

综上，在高血压大鼠的中枢发病机制中，小脑GABA含量的降低与Glu的含量的升高可能是其原因之一。对SHR大鼠施以针刺捻转补泻手法均能显著降低血压，使小脑GABA含量升高、Glu含量降低，且不同手法具有截然不同的效应性，这可能是针刺调控血压的中枢机制之一。本实验中泻法组对血压和小脑中2种神经递质的调节最显著，降压效果最佳，与补法组和电针组相比差异最明显，从而验证了针刺手法的有效性和差异性；补法组与电针组相比并无统计学差异，但电针组发挥降压效应较早，可能是电针组低频刺激，参数可控的特点导致。本实验设计和操作过程尚存不足之处，针刺捻转补泻对小脑参与降压的机制尚未完全阐明，有待进一步研究。