乳品中致敏蛋白的检测与控制研究进展

翁俊杰，艾蓉，汤旭翔，傅玲琳，王彦波，刘继超，刘福奇，*

（1.浙江工商大学，浙江杭州310018；2.北京三元食品股份有限公司，北京100163）

食物过敏目前已成为全球共同关注的健康安全问题之一，在过去的十几年里，食物过敏影响了近8%的成人和5%的儿童[1]。前期研究表明，牛奶、鸡蛋、大豆、花生、小麦、坚果类、鱼及甲壳类是主要的8 种致敏食物，据统计将近90%的食物过敏都是由这8 种食物引起的[2]。近些年，随着乳品的普及，由乳品引发的过敏问题也随之增多，在婴幼儿中牛乳过敏的比例高达2%～6%[3]。此外，随着食品工业的快速发展，除了乳品本身，乳品中蛋白质还可以作为原料或者辅料用于制作其他食品，如利用乳清蛋白的持水性、搅打起泡性、乳化性等特性制作面包、饼干、黄油、冰淇淋等食物。因此导致乳品中致敏蛋白也会存在于其他食物中，进而产生致敏隐患。因此如何快速、准确地检测乳品中的致敏蛋白以及在加工过程中如何更好地控制和降低致敏蛋白的含量显得至关重要，对减少乳品过敏现象的发生和降低其对人体健康的危害具有重要的现实意义。本文简要地综述了近年来乳品中致敏蛋白检测和控制方法的研究进展及发展趋势。

1 乳品中致敏蛋白的检测

1.1 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）已广泛应用于乳品等食物过敏原检测，具有高准确度和高灵敏度且操作简单便捷，可以用于快速、准确地定性和定量分析乳品中过敏原。竞争性ELISA 法和双抗体夹心ELISA 法是目前用于牛奶过敏原检测的两种主要技术方法。抗体的特异性和效价对ELISA 的检测结果具有重要影响，双抗体夹心ELISA 法结合了单克隆抗体特异性强和多克隆抗体灵敏度高的优点，研究证实可以达到更好的检测效果[4]。李亚璞等[5]选择新西兰大白兔和BALB/c 小鼠为实验动物，用牛乳中的β-乳球蛋白抗原分别对其免疫制备抗体，通过抗体纯化和特异性测定，制备出具有高特异性和高效价的鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体。该双抗体夹心ELISA 得到的检测结果准确性较高，且与食品中的其他致敏蛋白没有发生显著交叉反应。He等[6]使用兔抗β-乳球蛋白多克隆抗体开发夹心ELISA法，β-乳球蛋白检测的线性范围为31.25 ng/mL～8 000 ng/mL，具有高度的灵敏度和可靠性且其最低检测限能达到1.96 ng/mL。该法准确检测了乳品中β-乳球蛋白的含量，且样本中的β-乳球蛋白平均回收率为104.25%，可用于检测乳品中的β-乳球蛋白。当然，ELISA 法也存在不足之处，目前尚无法解决含有多种过敏原的乳品等复杂样品，且受环境的影响较大，存在潜在交叉污染问题。此外食品加工过程中的热处理、酶解等工艺都可能在一定程度上改变乳品等食物中的蛋白结构，从而改变抗体结合部位，干扰致敏蛋白的ELISA 检测结果。

1.2 毛细管电泳法

毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）是一种以高压直流电场作为驱动力和毛细管作为分离通道的液相分离技术，目前已经应用于乳品中蛋白致敏原的检测。研究表明，牛乳中主要的蛋白，包括乳清蛋白、乳球蛋白、酪蛋白及其主要降解产物para-κ-酪蛋白均可通过毛细管区带电泳法进行鉴别。Omar 等[7]通过毛细管电泳法成功鉴定和定量了骆驼奶中的乳清蛋白质和酪蛋白，其得到的检测图谱与凝胶电泳法（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）一致，但毛细管电泳法分辨率更高、更加易于操作且成本相对低廉。Trimboli 等[8]借助于CE法，对羊奶和牛奶的可识别且独特的蛋白质谱进行分析，成功定量了羊奶、牛奶混合物中的单一成分含量。但是传统毛细管电泳法存在电泳过程中产生样品吸附等问题，从而造成该方法的灵敏度和分离性能下降。为了解决这一问题，刘一等[9]通过对试验条件和样品处理的完善优化，发明了一种快速高效的毛细管区带电泳法。在 25 ℃，30 kV 电压，pH=7.0 的磷酸盐缓冲液，压力进样5 kPa，紫外检测波长205 nm 等的试验条件下，实现了基线分离，经过试验优化后检测限也大大降低，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的检出限分别达到了3.0 mg/mL 和12 mg/mL，从而解决了电泳过程中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的样品蛋白吸附问题。

1.3 聚合酶链式反应检测

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测的灵敏度高、特异性强，可以用于痕量或成分复杂的乳品过敏原分析。关潇等[10]根据已知过敏原α-乳白蛋白的基因序列设计了相应的引物，用该特异引物进行PCR 扩增后其灵敏度可达0.04 ng DNA，然后用该PCR 法成功检测添加在其他食品中的乳白蛋白。研究表明，普通PCR 得到的检测结果需要电泳验证才能确定，而且在试验过程中受环境影响较大，易发生交叉污染，影响其检测结果，实时荧光PCR 解决了上述问题。贾敏等[11]针对β-乳球蛋白基因序列设计了探针，并基于该探针开展了乳品中β-乳球蛋白实时荧光定量PCR 检测，变异系数在5%以内，具有快速高效、特异性强、灵敏度高的特点。Seçkin 等[12]通过实时PCR研究了90 种不同的奶酪，确定了奶酪生产中所使用的牛奶的数量和来源，且该实时PCR 已多用于鉴定乳制品来源的动物物种，为后续过敏原的研究和检测提供了一定借鉴。虽然目前关于实时PCR 在乳品检测中应用的报道较少，但它可以弥补普通PCR 的不足，是一种具有前瞻性的检测技术。

1.4 液相色谱-质谱联用技术

液相色谱-质谱联用技术同样是在乳品过敏原检测方面应用较多的方法，可以实现过敏原的多重定量[5]。Heick 等[13]提出了一种基于液相色谱-三重四极杆质谱的多反应模式，可以同时检测7 种过敏原的方法。检测浓度范围为10 μg/g 至 1 000 μg/g，其中牛奶检测浓度可低至10 μg/g，证明基于液质联用的方法是过敏原筛选的有效工具。袁明美等[14]开发了用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）测定乳品中β-乳球蛋白含量的办法，灵敏度和准确度都较高，检测限可达到1 nmol/L。牛奶酪蛋白是葡萄酒澄清过程中常用的蛋白质，也是葡萄酒的主要过敏原，存在致敏隐患。Tolin 等[15]用十二烷基硫酸钾和十二烷基硫酸钠进行蛋白预处理，并借助于LC-MS/MS 法准确检测鉴定了残留的澄清蛋白质浓度，分析快速准确，有效地克服了传统免疫学方法的局限性。Ji 等[16]开发了基于液相色谱-串联多反应检测质谱（liquid chromatography-tandem multiple reactions-monitoring，mass spectrometry，LC-MRM/MS）确认和量化食品中牛奶过敏原的方法。在37 ℃，16 h 的反应条件下用酶水解α-乳白蛋白（α-La）、αs1-酪蛋白（αs1-CN）、β-乳球蛋白（β-Lg），再通过使用基质辅助激光解吸/电离-串联时间飞行质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization with tandem time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF MS）对其进行标识验证，α-La，β-Lg 和 αs1-CN的线性范围分别为 0.97 μg/mL～31.25 μg/mL，0.48 μg/mL～31.25 μg/mL 和 0.48 μg/mL～31.25 μg/mL。蛋白质组学的发展为质谱在蛋白水平和肽段水平的定性、定量分析提供了可能。此外，多反应检测在质谱的广泛应用使得质谱的特异性、灵敏度、准确度和重现性都显著提高。

2 乳品中致敏蛋白的控制

2.1 热处理

蛋白质的结构或空间构象经热处理会发生改变形成聚合物，这些聚合物可以在一定程度上掩盖致敏蛋白表位而使蛋白致敏性降低。Fuente 等[17]和Considine 等[18]研究发现热处理会导致α-乳清蛋白和β-乳球蛋白发生聚集，且随着处理温度的升高，大分子量聚集体的数量不断增加，使蛋白潜在致敏性显著下降。目前在乳品中广泛使用的热处理方式有超高温瞬时杀菌、高温短时巴氏杀菌和二次杀菌。Mehr 等[19]研究表明，70 名对牛乳有过敏反应的儿童摄入经强加热处理的牛乳，结果只有19 名儿童显现过敏症状，证实了热处理法确实可降低致敏蛋白的致敏性。

研究表明，虽然经过热处理后会降低乳品致敏性，但在处理过程中乳品的营养价值和风味特性也会发生不同程度的变化。而且由于在热处理过程中存在化学键断裂和重新形成，可能产生新的抗原表位；或经过热处理可能会使蛋白质内部的抗原表位暴露，这些都有可能增强其致敏性。蛋白的热敏性不同和处理方法的不同也会对处理结果产生影响。Xu 等[20]对牛奶蛋白质浓缩物进行热处理研究发现，α-乳白蛋白经过65 ℃～100 ℃的热处理后其潜在致敏性有显著的下降，但是β-乳球蛋白的抗原性在85 ℃和100 ℃下热处理25 min 后迅速增加，与未处理的样品相比，热处理后β-酪蛋白的潜在致敏性显著增加。费爽雯等[21]研究了不同温度的热处理对牛乳中过敏原蛋白致敏性的影响，结果发现经过加热处理的α-乳白蛋白与免疫球蛋白G（IgG）的结合能力相比于未处理的有显著增强，β-乳球蛋白的抗原性随着热处理强度的增加反而逐渐降低。综上所述，乳品中致敏蛋白的致敏性受热处理方式的影响，热处理的效果与处理温度、时间、蛋白质的内部特征以及物化条件等有关，因此在研制低过敏性乳制品过程中，需要优化全产业链中热处理相关条件，避免引起抗原性增强的情况。

2.2 糖基化作用

蛋白质的糖基化作用是碳水化合物与蛋白分子上的氨基通过共价键发生结合的化学反应（包括美拉德反应）。研究表明，食品中的蛋白质经过糖基化修饰可以改善蛋白分子的乳化性、抗氧化性、热稳定性、起泡性等功能特性，而且可以修饰改变蛋白分子上的抗原表位使其致敏性降低。Wu 等[22]先将β-乳球蛋白分别与低聚异麦芽糖（isomaltooligosacharides，IMO）、低聚半乳糖（galactooligosaccharides，GOS）和低聚果糖（fructooligosaccharides，FOS） 进行反应，再借助于ELISA 法分析反应前后β-乳球蛋白与免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）和免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）结合能力，结果发现经过糖基化处理的β-乳球蛋白的抗原性有明显降低。María 等[23]研究同样发现了酪蛋白糖巨肽（casein glycol-macro-peptide，CMP）可以减少β-乳球蛋白消化产物的表位从而使牛乳中β-乳球蛋白的潜在致敏性降低。

研究表明，美拉德反应中的反应条件如反应底物的质量比、温度、时间等均会影响过敏原致敏性的降低程度。Li 等[24]研究在不同美拉德反应条件下乳清蛋白分离物中β-乳球蛋白致敏性的变化，并优化美拉德反应条件，结果发现在最佳美拉德反应条件下通过用寡聚体异构体糖基化，β-乳球蛋白的抗原性从272.4 μg/mL 降至 30.99 μg/mL，有效降低了约 88.6%。Cardoso 等[25]通过用不同糖类诱导各个乳蛋白的美拉德反应，结果发现对于所有的蛋白质-糖类组合，α-乳清蛋白比β-乳球蛋白更具反应性。美拉德反应虽然可以有效降低致敏性，但由于难以控制反应过程中的复杂变化，可产生一些副产物影响乳品的营养风味，甚至危害人体健康，所以在低敏乳品开发时应充分考虑其安全特性和营养价值，需要严格控制美拉德反应的条件以避免有害物质的生成。

2.3 酶水解

胃蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶、中性蛋白酶等是目前普遍用于乳品致敏蛋白水解的酶类。这些蛋白酶通过对蛋白质进行水解使其分子量减少，同时还会破坏蛋白质分子上的一些与过敏反应相关的线性表位和空间表位从而降低致敏蛋白的致敏性。近年来科学研究者一直在寻找更适合加工处理的酶，Oliveira 等[26]发现黑脉金斑蝶（D.Plexippus）中的肠道肽酶能够进行牛奶中蛋白质水解。经肽酶水解后，再经热处理，β-乳球蛋白的水解性得到进一步显著提升，降低了潜在的致敏性。此外，研究中还评估了4 种不同肽酶，发现来自橡胶紫茉莉的乳胶肽酶（cryptostegia grandiflora latex proteins，CgLP）和番木瓜的乳胶肽酶（carica papaya latex proteins，CapLP）在降低抗原性和变应原性方面表现出最佳性能，可作为水解牛奶中蛋白质用肽酶的新来源，具有广泛的应用前景[27]。

研究表明，酶的种类、酶解方式和条件都与致敏蛋白的水解程度有关。各个酶的作用位点均有差异，具体见表1，因此多种酶的共同应用可显著克服单一酶水解位点的局限性，更好的降低乳品蛋白致敏性。付莉等[28]研究发现用风味蛋白酶和胰蛋白酶对牛乳蛋白进行水解，其蛋白致敏性明显降低。酶法水解和其他加工处理技术结合使用同样可以有效降低乳品致敏性，Azdad 等[29]以1000 名对牛奶敏感的摩洛哥人为研究对象，将牛奶中酪蛋白进行热处理和胃蛋白酶水解，结果显示，仅3.6%的人报告对牛奶过敏，表明通过热处理和胃蛋白酶水解足以消除该研究群体中酪蛋白引起过敏反应的大多数表位，其原因可能是加热变性消除了构象表位，同时胃蛋白酶作用在顺序表位上变得更有效。当然，酶水解只能在一定程度上降低乳品蛋白的致敏性，但不能完全消除。在处理过程中，酶类型和反应条件的差异可能导致乳品的风味差异。

2.4 乳酸发酵

乳酸发酵也可以在一定程度上降低乳品蛋白致敏性。研究表明可能的主要机制有两种，一是乳酸菌在发酵过程中会产生一些肽酶、蛋白酶等具有水解作用的酶，这些酶会水解乳品中的过敏原蛋白，进而降低蛋白致敏性；二是乳酸菌能降低炎症性细胞因子的分泌，可有效调节人体免疫系统，从而减少过敏[31]。研究发现，发酵菌种和发酵条件对牛乳蛋白的抗原性有重要影响，目前国内外可降低牛乳致敏性的发酵菌种见表2。

表2 可降低牛乳蛋白致敏性的发酵菌种Table 2 Fermentation strain that can reduce the allergenicity of milk protein

2.5 其他方法

此外，研究发现高压、微波、辐照、超声波等加工方式可改善乳品致敏性。高压处理通过影响致敏蛋白分子中的疏水键和非共价键，从而改变蛋白质的空间构象，起到降低蛋白致敏性的作用。Daniel 等[32]发现高压预处理增强了胃蛋白酶水解乳清蛋白的能力，更好地降低了乳清蛋白的致敏性。高静水压力和高压微射流技术是目前的研究热点，王伟等[33]介绍了目前高静压技术在降低食物致敏性方面的研究进展。Chen 等[34]研究发现经过动态高压微流化（dynamic high-pressure microfluidization，DHPM）处理后，半乳糖糖化的β-乳球蛋白与IgE 结合能力得到了有效的降低。高强度超声波处理也可以更有效降低致敏性，Liu 等[35]探究了超声波预处理对β-乳球蛋白糖化和变应原性的影响，结果发现其致敏性显著降低。Ma 等[36]研究发现超声波处理增加了β-乳球蛋白被胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的程度。以上加工技术对乳品的成分改变较少，减少了营养流失，与酶解、发酵等方法相结合，同样可以更大程度地降低乳品蛋白的致敏性。

3 展望

乳品过敏原检测对评价乳品的安全性至关重要。虽然随着研究的深入，各个检测技术的准确性和灵敏度都有了很大的提高，也不断有新的技术被发掘，但如何准确地检测评估乳品加工过程中的致敏蛋白以及如何排除其他蛋白对检测的干扰仍是本领域面临的难题。借助于新的技术手段和理论创新，乳品中致敏蛋白的检测将更加快捷和准确，以确保乳品安全。目前部分加工处理技术已经可以有效降低乳品中致敏蛋白的致敏性，但对处理过程中发生的复杂的物理化学变化以及影响机制尚不明确，此外，在处理过程中乳品风味改变、致敏性增强，甚至产生有安全隐患的副产物等情况依然存在，实际上这些已经成为影响乳品行业发展的瓶颈问题。因此在后续研究过程中，需要进一步探究致敏蛋白关联的乳品加工全过程中产生的理化变化，保障乳品的食用品质。