孙也,潘娅婧,杨菁楠,侯旭彤,王金菊,王艳萍
(天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津300457)
据世界卫生组织统计,目前全球抑郁症患者已达3.22 亿,占全球范围内总人口数的4.3 %[1]。我国从2005 年到2015 年,抑郁患者数量增加了18.4%。据不完全统计,目前我国抑郁症发病率高达5%~6%,而且发病率近年来呈逐年上升的趋势。抑郁症患病人群主要集中在孕妇、产后妇女及老年人,年龄小于15 岁的儿童和青少年也有发生。不同文化程度、国籍、地域、工作岗位、年龄的人群患病率各不相同[2]。抑郁症严重影响我们的生活、学习和健康。抑郁症已成为科研工作者攻克的难题和研究的热点。
目前抑郁症主要的治疗措施是药物治疗,然而药物具有很大的副作用。所以开发一款天然、无副作用的抗抑郁制剂来替代抗抑郁药物成为研究热点。目前国内外研究人员已经证实多种益生菌菌株可显著缓解抑郁或焦虑,并有望成为抗抑郁药的替代品[3-15]。
然而在进行抗抑郁乳酸菌的筛选时,模型的选择十分重要。本试验选用明暗箱和高架十字迷宫来评估小鼠的焦虑样行为。明暗箱实验是基于啮齿动物对明亮光照区域的天生厌恶,以及啮齿动物对温和应激源(即新的环境和光线)的自发探索行为[16];高架十字迷宫测试可以评估小动物的焦虑样行为。正常健康的小动物会出于好奇对新环境进行探索,表现为在开臂的逗留时间增加;选用悬尾试验实验来评估小鼠的抑郁样行为。悬尾实验已经成为评估小鼠抗抑郁类药物活性最广泛使用的模型之一,这项测试是基于这样一个事实:动物在短期内,不可避免地承受着被尾巴悬挂的压力,它们会形成一种不动的姿势。各种抗抑郁药物逆转了这种静止状态,促进了逃避行为的发生[17-18]。
本试验采用行为学模型来评估7 株乳酸菌的抗抑郁样行为和抗焦虑样行为,为以后的研究提供基础。
JA2003 电子分析天平:上海精科天平厂;DWYL270 冰箱:中科美菱公司;YQX-2 厌氧培养箱:上海跃进医疗公司;LGR20 高速冷冻离心机:北京京立离心机。
氯化钠(分析纯):北京奥博星生物技术有限公司;5-羟色胺测定试剂盒、皮质酮测定试剂盒:天津莱博科技有限公司。
主要采用以下菌株用于本研究,试验菌株信息表见表1。菌种保藏在中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。7 株乳酸菌在MRS 肉汤培养基(葡萄糖20.0 g/L;蛋白胨10.0 g/L;牛肉膏10.0 g/L;酵母膏5.0 g/L;磷酸二氢钾2.0 g/L;柠檬酸铵2.0 g/L;醋酸钠5.0 g/L;吐温80 1.0 g/L;硫酸锰 0.05 g/L;硫酸镁 0.2 g/L)中 30 ℃培养48 h。昆明雄性小鼠(SPF 级,北京斯贝福),饲养于天津科技大学屏障系统动物房中。所有试验均依照《天津科技大学动物管理与使用指南》进行。
1.3.1 动物实验设计
试验小鼠在适应环境一周之后被随机分成8 组,每组8 只,分别为空白对照组、ZW3 组、WHC1 组、MA2 组、299 组、563 组、XL10 组、W120 组。空白对照组每天灌胃无菌生理盐水(0.85 %)0.4 mL;乳酸菌组每天灌胃 0.4 mL 菌液(108CFU/mL)灌胃 4 周。
四是“订单式”培训模式。“订单式”培训可以根据地区特有的产业特色,将农民生产中的需求与就业、培训建立了对应关系,进而生成高效的衔接机制。该模式可以重点用于对农民实用技术和增收致富技能等的培育,例如教会农民养殖技术、种植实用技术等。
1.3.2 明暗箱实验
明暗箱实验方法参考Premysl bercik[19]。实验需要在安静环境下进行,将动物放入长宽高分别为80、80、40 cm 的箱内(一半有遮挡为暗箱,一半敞箱为明箱),将动物放入敞箱后开始测定,每次计时10 min,记录单位时间内动物在亮箱中停留的总时间。小鼠在亮处停留时间越长说明小鼠越不焦虑。
1.3.3 高架十字迷宫实验
高架十字迷宫实验方法参考Bravoa 中的描述[20]。实验装置包括两个开臂和两个闭臂,开臂由两个两边长为100 cm 平台构成无护栏;闭臂由两个两边长为100 cm 平台构成,合臂边缘有20 cm 护栏。测试中,将测试小鼠放置在十字中央区域,随即开始记录与观察小鼠在开臂中停留的时间,测试进行5 min。与对照相比,在开臂停留时间越短表明小鼠对新环境的探究能力差,从而体现出焦虑抑郁样行为。
1.3.4 悬尾实验
悬尾实验实验方法参考徐立[21],当被悬挂的小鼠静止不动则视为抑郁。将小鼠尾端1 cm 的部位贴在一铁架夹上,头朝下,使小鼠前后左右均无攀抓的地方,一段时间后小鼠因绝望而活动减少,记录小鼠6 min内后4 min 的不动时间。
1.3.5 强迫游泳实验
强迫游泳实验方法参考Cryan 中的描述[21]。强迫游泳实验是经典的抑郁模型,通过小鼠在水面漂浮的不动时间可以检测小鼠抑郁行为。强迫游泳实验前,分别将小鼠置于强迫游泳缸(水深10 cm、直径16 cm、水温保持在25 ℃)内进行预适应游泳15 min,然后用毛巾擦干,24 h 后进行强迫游泳6 min,计算小鼠后4 min 在水面漂浮的累计不动时间。不动时间判断标准:小鼠停止挣扎或呈漂浮状态,四肢有轻微动作以保持在水面漂浮即为不动。
1.3.6 生物标记物的测定
1)小鼠于最后一次行为学测试后禁食24 h 处死,各组小鼠摘眼球取血,取得的血液收集在无菌的1.5 mL EP 管中,迅速在4℃,6 000 r/min 的条件下离心10 min后取上清,将收集的血清用液氮冷冻之后存储在-80 ℃直至使用[21]。
2)断头取脑,随即迅速于冰面上分离出下丘脑,并根据实验要求分装于1.5 mL EP 管中,置于液氮冷冻之后存储在-80 ℃直至分析。
3)使用酶联免疫分析ELISA 试剂盒检测各指标,按试剂盒说明书进行操作
所有数据均以均值±标准差表示,采用One-way ANOVA 比较差异。p<0.05 有统计学意义。
为评估乳酸菌对健康小鼠焦虑样行为的作用,分别观察灌胃乳酸菌2 周和4 周时,小鼠在明暗箱实验的情况。将动物放入敞箱后开始测定,每次计时10 min,记录单位时间内动物在亮箱中停留的总时间。结果如图1 所示。
由图1 可知,与空白小鼠相比,灌胃了益生菌的实验组小鼠在亮箱中停留时间更长一些;灌胃2 周时,除了XL10,益生菌组在亮箱中停留时间都显著的高于空白组(p<0.05);灌胃4 周时,益生菌组与空白组相比在亮箱里的停留时间显著增加(p<0.05)。表明灌胃益生菌 2 周时 ZW3、MA2、299、W120、563、WHC-1 菌株可显著改善小鼠的焦虑样行为,并且继续灌胃至第四周时,也表现出了相同的效果。之前的一份报告指出,A-gusti 给感染了T.muris 的小鼠服用B.longum 后,与未感染的正常小鼠相比,小鼠在亮箱中停留的总时间正常化[22]。结果表明Lb.kefiranofaciens ZW3 可改善小鼠在新环境中的焦虑样行为。
图1 各组小鼠在明暗箱中亮箱停留时间Fig.1 Time in light box
采用高架十字迷宫实验,进一步评估益生菌对健康小鼠焦虑样行为的作用,我们观察了灌胃乳酸菌四周时,小鼠在高架十字迷宫实验的情况。将测试小鼠放置在十字中央区域,随即开始记录与观察小鼠在开臂中停留的时间,测试持续5 min。结果如图2 所示。
图2 灌胃益生菌四周时各组小鼠在开臂中停留时间Fig.2 Stay time of open arm of mice were administered for four weeks
由图2 可知,灌胃益生菌四周时,与空白对照组相比ZW3、MA2、299 可显著增加小鼠在开臂中的停留时间(p<0.05)。Bravo 研究发现长期服用鼠李糖乳杆菌(JB-1)可以延长小鼠在高架十字迷宫中开臂的停留时间[20]。另一份报告显示,服用Lactobacillus helveticus NS8 的限制性应激大鼠,在高架十字中开臂的探索时间增加[23]。表明益生菌可改善小鼠在新环境中的焦虑样情绪。
采用经典的行为绝望模型悬尾实验,来评估乳酸菌对实验小鼠的作用效果。将小鼠尾端1 cm 的部位贴在一铁架夹上,头朝下,使小鼠前后左右均无攀抓的地方,一段时间后小鼠因绝望而活动减少,记录小鼠6 min 内后4 min 的不动时间。结果如图3 所示。
图3 各组小鼠在悬尾中不动时间Fig.3 Immobility time of tail suspension test administered for four weeks
由图3 可知,灌胃益生菌2 周时,与空白组小鼠相比,ZW3、299、MA2、W120 组小鼠的不动时间明显降低;继续灌胃益生菌到第四周时,ZW3、299、MA2、563、XL10 组小鼠不动时间与对照组相比明显下降(p<0.05),但是不动时间较2 周有所延长。结果说明ZW3,299,MA2 在灌胃 2 周时就具有减轻小鼠抑郁样行为的潜能,而563,XL10 在灌胃4 周时才表现出减轻小鼠抑郁样行为的潜能。
通过明暗箱和高架十字迷宫实验评价7 株益生菌对健康小鼠在新环境中抗焦虑样行为的作用效果:综合结果显示ZW3、MA2、299 在两个行为学实验中均可改善小鼠在新环境中的焦虑样行为;通过悬尾实验评价7 株益生菌对健康小鼠在行为绝望模型中的作用效果:综合结果显示 563、ZW3、MA2、299、XL10 在两个行为学实验中均可改善小鼠的抑郁样行为。
本文通过行为学筛选到3 株抗抑郁/抗焦虑样行为的乳酸ZW3、MA2、299 作为后续研究的菌株。
行为学测试结束后,对小鼠进行解剖,用电子天平测量各脏器的质量,结果如表2 所示。
表2 益生菌对小鼠脏器指数的影响Table 2 Effect of probiotics on the organ index in SPF mice
在试验期间,各组小鼠均健康良好,皮毛光泽干净,饮食正常,没有死亡现象,表明这3 株乳酸菌对小鼠没有副作用。
采用ELISA 方法测定抑郁相关生物标记物血清素和皮质酮的含量,结果如图4 所示。
图4 Lb.kefiranofaciens ZW3 对小鼠体内生物标记物的作用Fig.4 Lactobacillus kefiranofaciens ZW3 administration influenced biomarkers levels in mice
脑区内5-羟色胺(serotonin,5-HT)水平低或者抑制血清素分泌的功能被认为是抑郁症发病的机制[24]。由图4(a)可知,与空白组相比,补充益生菌ZW3、MA2、299 可以增加下丘脑中5-HT 的含量;当宿主受到压力时,下丘脑释放促肾上腺皮质激素释放激素,诱导垂体释放促肾上腺皮质激素,从而导致肾上腺皮质释放皮质酮,皮质酮等物质调控肠道免疫细胞的活动,影响肠道的渗透性和屏障功能并改变肠道菌群的结构[25]。由图4(b)可知,与空白组相比,补充益生菌ZW3、MA2、299 可以降低血清中皮质酮的水平。结果表明ZW3、MA2、299 可以调节抑郁相关的生物标记物。
通过明暗箱和高架十字迷宫来评估饮食中补充乳酸菌对健康小鼠焦虑样行为的作用效果,结果表明,ZW3、MA2、299 可以增加小鼠在明暗箱中亮箱的停留时间,以及小鼠在高架十字迷宫中开臂的探索时间,从而改善了健康小鼠在面对新异环境的焦虑样情绪;通过悬尾实验来评估饮食中补充乳酸菌对健康小鼠抑郁样行为的作用效果,结果表明,563、ZW3、MA2、299、XL10 可以降低小鼠在悬尾实验中的不动时间,从而改善了健康小鼠在面对应激的抑郁样情绪。本文通过行为学筛选到3 株抗抑郁/抗焦虑样行为的乳酸ZW3、MA2、299 作为后续研究的菌株。同时 ZW3、MA2、299 还可以增加小鼠下丘脑中5-HT 含量,降低小鼠血清中皮质酮含量。综上所述,ZW3、MA2、299 可以改善小鼠的焦虑样行为和抑郁样行为,并且初步探讨了这些行为的改变可能和体内生物标记的水平相关。为今后的研究提供了基础。