不同产地葛根蛋白质提取工艺及其功能性研究

唐婷范，杨杰，黄芳丽，程昊，朱家庆，梁杰婷，黄青勇，田玉红

（广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州545006）

葛根（Pueraria lobata）是豆科植物野葛的干燥根，可分为野葛和粉葛[1]，在我国的大部分省份都有分布。葛根被人赞誉为“亚洲人参”，具有解表退热，生津、透疹、升阳止泻等多种功能。葛根的化学成分丰富，主要活性成分有大豆素、葛根素等，同时还含有丰富的淀粉、蛋白质、多糖和挥发油等成分。葛根作为中药其药用价值非常高，其药效的主要成分是葛根当中的总黄酮、葛根素、大豆甙元、三帖皂苷和乙酰胆碱等[2]。刘红芹等[3]认为葛根、桑叶、苦瓜、苦荞配方的提取物对II型糖尿病具有辅助治疗的作用。熊东妮等[4]认为葛根对妇科病具有一定的治疗作用。如果挖掘出葛根潜在的营养价值和药用价值，将葛根制成具有功能性的食物、饮料或者药物，会有广阔的市场前景。

蛋白质是国内外的研究热点[5]，蛋白质的功能性质是由食品在加工、储藏、运输和消费的过程中产生的。这些特征具体包括了蛋白质溶解度、持水油性、乳化性、起泡性和胶凝性等。本试验以不同产地葛根为原料，运用凯氏定氮法分别测定广西北海、贵港和柳州葛根中的蛋白质含量，并采用普通回流法提取葛根蛋白质，计算葛根蛋白质的提取率。并以蛋白质提取率为考察指标[6]，通过单因素试验和正交试验法[7]分析提取温度、提取时间、液料比以及提取溶剂的pH 值对提取率的影响。并对葛根蛋白质的功能性做初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葛根：选用广西北海野葛、贵港野葛和柳州粉葛。五水硫酸铜：天津市化工三厂有限公司；硫酸钾、无水碳酸钠：天津市致远化学试剂有限公司；酒石酸钾钠、甲基红指示剂：天津市福成化学试剂厂；硫酸、盐酸、硼酸、氢氧化钠：成都市科隆化学品有限公司；溴甲酚绿指示剂：天津市科密欧化学试剂有限公司；95%乙醇：东莞市斯巴达化学有限公司；碘化钾：成都金山化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯；牛血清白蛋白标准品：上海金穗生物科技有限公司。

1.2 仪器设备

GZX-GF101-4-S 电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械厂；DFY-600C 摇摆式高速粉碎机：浙江省温岭市大机械有限公司；GG-17 凯氏定氮装置：厦门仕福玻璃仪器厂；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市京华仪器有限公司；V2000 可见分光光度计：奥豪斯仪器（上海）有限公司；TDL-80-2B 低速台式离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；ZY-LDG12 真空冷冻干燥机：上海紫裕生物科技有限公司；FSH-2A 可调高速均质机、AR124CN 电子分析天平：上海舜余恒平科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葛根蛋白含量的测定

将不同产地的葛根洗净、烘干和粉碎，然后过40目筛，得到葛根粉。根据凯氏定氮法[8]分别测定3 种产地葛根粉中蛋白质总含量。

1.3.2 标准曲线的建立

称取（0.005 0±0.000 3）g 牛血清蛋白于烧杯中，用少量水使其溶解，定容到10 mL 容量瓶中，得到浓度为5 mg/mL 的牛血清蛋白标准溶液[9-10]。

称取0.75 g 的硫酸铜和3.00 g 的酒石酸钾钠溶于250 mL 水中，加入10%的氢氧化钠溶液150 mL 混匀（加入1.00 g KI 以防止Cu2+自动还原成Cu+，生成Cu2O沉淀），最后稀释到500 mL，得到双缩脲试剂[11]。

分别准确移取 0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的牛血清白蛋白标准溶液于比色管中并编号，然后加入4.0 mL 双缩脲试剂于（37±2）℃水浴锅中反应30 min后用可见分光光度计在540 nm 处测其吸光值，空白管调零。

1.3.3 葛根蛋白的提取工艺

称取一定量葛根粉，加入一定液料比[10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）]和 pH 值（5、6、7、8、9）的提取溶剂，于一定温度（30、40、50、60、70 ℃）回流提取一定时间（0.5、1、1.5、2、2.5 h），将提取液在 3 000 r/min的转速下离心20 min，取一定上清液加入显色剂反应30 min，用V2000 可见分光光度计测定吸光度，计算蛋白质提取率[12]。

将剩余上清液的pH 值调为4.5，然后静置12 h后，真空离心20 min 得到蛋白沉淀，将蛋白沉淀放入真空冷冻干燥机[13]，干燥12 h 后得到葛根蛋白样品，放入干燥皿备用。

1.3.4 蛋白的功能性性质测定

1.3.4.1 持油性试验

取10 mL 离心管，称其质量为m0，加入0.1 g 蛋白样品，其质量为m1，再加入金龙鱼花生油2 mL，在室温下振荡15 min，使其溶解均匀，静置5 min；用低速离心机以4 000 r/min 的速度离心15 min，弃去上清液；用滤纸吸干壁上油珠，称其离心管和吸油蛋白的质量为m2。根据公式计算出持油力[14]。

式中：m0为空离心管质量，g；m1为蛋白样品质量，g；m2为离心管和吸油蛋白样品质量，g。

1.3.4.2 持水性试验

取10 mL 离心管，称其质量为m0，加入0.1 g 蛋白样品，其质量为m1，再加入pH 7 的蒸馏水2 mL，使其搅拌溶解均匀后放在60 ℃水浴锅中加热30 min，冷却。用低速离心机以4 000 r/min 的速度离心15 min，弃去上清液；用滤纸吸干壁上水珠，称离心管和吸水蛋白的重量为m2。根据公式计算出持水力[14]。

式中：m0为空离心管质量，g；m1为蛋白样品质量，g；m2为离心管和吸水蛋白样品质量，g。

1.3.4.3 乳化性试验

称取0.10 g 蛋白样品分散于装有2 mL 蒸馏水的离心管中内，再加入2 mL 的金龙鱼花生油，振荡摇匀。用高速均质机下用3 档均质2 min，均质结束后，用低速离心机在1 500 r/min 的速度下离心5 min，分别测量离心管内样品总高度和乳化层高速。根据公式计算出乳化率[15]。

1.3.4.4 起泡性实验

称取0.10g 蛋白样品于10 mL 量筒内，加入pH 7的蒸馏水9 mL，在高速均质机下用3 档均质2 min，均质结束后测量泡沫的体积。根据公式计算起泡率[15]。

2 结果与分析

2.1 葛根蛋白质总含量

根据凯氏定氮法测定广西贵港野葛蛋白质含量为12.27%，北海野葛蛋白质含量为10.36%，柳州粉葛蛋白质含量为9.34%。

2.2 标准曲线

以蛋白质浓度（mg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线图见图1。

图1 牛血清白蛋白标准曲线Fig.1 Bovine serum albumin standard curve

由图1 可知标准方程式为Y=0.063 2X+0.004 8，决定系数R2=0.999 4，线性情况较好；所以牛血清白蛋白标准曲线的线性范围在0.5 mg/mL～5.0 mg/mL。

精密度试验按照“1.3.3”的步骤方法称取葛根粉进行提取、离心和显色，同时做6 个平行样，然后用可见分光光度计在540 nm 处分别测定吸光值，结果如表1所示。

表1 精密度试验结果Table 1 Results of precision experiments

根据表1 可得，平均提取率为（58.49±0.91）%，相对平均偏差为0.91%，说明该方法精密度好。

加标回收率试验按照“1.3.3”的步骤方法称取葛根粉进行提取、离心，同时做6 个试验。然后在每个比色管加入不同体积的2 mg/mL 牛血清蛋白标准溶液，最后显色。用可见分光光度计在540 nm 处测定其吸光值。结果如表2 所示。

表2 加标回收率试验结果Table 2 Results of recovery experiments

由表2 可以看到，葛根蛋白提取物的平均加标回收率为（98.94±1.69）%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.69%，说明双缩脲法对于测量葛根提取物中总蛋白质含量真实可靠，该法可行。

准确度试验按照“1.3.3”的步骤方法称取葛根粉进行提取、离心和显色，同时做6 个平行样，然后用可见分光光度计在540 nm 处测定其吸光值，20 min 内每隔2 min 测定一次。结果如表3 所示。

根据表3 可得，在20 min 内提取液的平均提取率为（59.45±0.54）%，RSD 为 0.54%，结果表明这种方法稳定性较好。

表3 准确度试验结果Table 3 Results of stability experiments

2.3 单因素考察结果

2.3.1 提取溶剂pH 值对蛋白质提取率的影响

称取 1.00 g 的葛根粉，加入料液比为 20 ∶1（mL/g）的水，将水 pH 值调为 5、6、7、8 和 9，于 50 ℃温度下提取1.5 h，将提取液进行离心、显色和测定，结果如图2所示。

图2 溶剂pH 值对蛋白提取率的影响Fig.2 The effect of pH valueon extraction rate of protein

由图2 可知，pH 值为 5、6、7、8 和 9 时，葛根蛋白质提取率分别为51.00%、52.57%、55.08%、56.37%和49.49%，在 pH 值为 5、6、7、8 时提取率逐渐升高，在pH 8 时达到最高，因为在弱碱性条件能使蛋白分子结构变得疏松，碱液对蛋白有促进溶解的效果。pH 在8～9时提取率急速下落和pH 5 时提取率很低，因为蛋白质在酸度过低和碱性过高下可以使蛋白质中的氢键断裂，从而导致蛋白质变性[16]，所以提取溶剂pH 8 为佳。

2.3.2 液料比对提取率的影响

称取 1.00 g 的葛根粉，加入 pH 8 液料比为 10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1 和 30 ∶1（mL/g）的水，于 50 ℃温度下提取1.5 h，将提取液进行离心、显色和测定，结果如图3 所示。

图3 液料比对蛋白提取率的影响Fig.3 Liquid to material ratio on extraction rate of protein

由图3 可知，在液料比的影响下，提取率分别为54.72%、55.07%、56.31%、54.95%和54.37%。提取率随液料比的增加先上升后下降。当液料比为20∶1（mL/g）时，提取率为最高。这可能是因为液料比较低时，提取溶剂较少，体系分散不均匀，蛋白质不能完全溶解[17]，所以当提取溶剂的液料比20 ∶1（mL/g）为佳。

2.3.3 提取温度对提取率的影响

称取 1.00 g 的葛根粉，加入 pH 8 液料比为20 ∶1（mL/g）的水，于 30、40、50、60、70 ℃温度下提取1.5 h，将提取液进行离心、显色和测定，结果如图4所示。

图4 提取温度对蛋白提取率的影响Fig.4 Extraction temperature on extraction rate of protein

由图4 可知，在提取温度的影响下，提取率分别为53.28%、54.43%、55.73%、51.97%和50.97%。提取率先缓慢上升，然后在快速下降，当温度为50 ℃时提取率55.73%为最高。因为温度过高会导致蛋白质变性，从而影响蛋白质的提取率[18]，所以当提取温度50 ℃时为佳。

2.3.4 提取时间对提取率的影响

称取1.00 g 的葛根粉，加入pH 8 液料比为20 ∶1（mL/g）的水。于 50 ℃温度下提取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，将提取液进行离心、显色和测定，结果如图5所示。

由图5 可知，在提取时间的影响下，提取率分别为50.50%、52.21%、57.63%、56.24%和54.60%。提取率先快速上升然后在缓慢降低，在提取时间为1.5 h，提取率最高为57.63%。这是因为提取的时间越长，蛋白质的溶出率就越高。但是时间太长会破坏蛋白质的结构[19]，从而影响蛋白质的提取，所以当提取时间1.5 h时为佳。

图5 提取时间对蛋白提取率的影响Fig.5 Extraction time on extraction rate of protein

2.4 正交试验及考察结果

由单因素试验可知对蛋白质提取率影响较大的3个因素是提取溶剂的pH 值、提取温度和提取时间。每个因素影响提取率较大的3 个水平是提取溶剂的pH 6、pH 7 和 pH 8，提取温度 30、40、50 ℃，提取时间1.5 h、2.0 h 和2.5 h。所以采取L9（34）的正交表进行分析，方案如表4 所示，以葛根蛋白提取率为评价指标，优化蛋白质的最佳提取工艺，结果见表5，其空列为误差列，对试验结果没有影响。

表4 正交试验因素水平表Table 4 Factors and levels of orthogonal experiment

表5 正交试验及其结果分析Table 5 Results of the orthogonal experiment

续表5 正交试验及其结果分析Continue table 5 Results of the orthogonal experiment

从极差R 分析得因素的主次为A＞C＞B，即提取溶剂pH 值＞提取时间＞提取温度；在A 因素中分析得提取溶剂的pH 值得主次为pH 8＞pH 7＞pH 6；在 B 因素中分析可得提取温度的主次为30 ℃＞40 ℃＞50 ℃；在C 因素中分析可得提取时间的主次为2.5 h＞2.0 h＞1.5 h。综上所诉，最优方案为A3B1C3，即提取溶剂的pH 8，提取时间2.5 h，提取温度为 30 ℃，提取率为57.28 %。

根据正交试验得出的最优方案和“1.3.3”的提取方法，分别对广西北海、贵港和柳州葛根进行蛋白质的提取并进行其提取率，结果如表6。

表6 葛根蛋白提取率Table 6 Extraction rate of Pueraria lobata protein

根据表6 可知，广西北海野葛蛋白质的提取率为58.87%、贵港野葛蛋白质的提取率为83.20%和柳州粉葛蛋白质的提取率为22.27%。

2.5 葛根蛋白功能性试验

由“1.3.4”的工艺步骤得出葛根蛋白的功能性，然后与大豆分离蛋白的功能性进行比对，结果如表7所示。

表7 葛根蛋白和大豆分离蛋白的功能特性Table 7 Functional properties of puerarin and soy protein isolate

葛根蛋白的持油率高于大豆分离蛋白的持油率；持水率、起泡率和乳化率都比大豆分离蛋白的低，但是相差不大。葛根为豆科植物野葛的干燥根，即葛根蛋白为豆科蛋白的一类，所以葛根蛋白的功能性和大豆分离蛋白的功能性相近。

3 结论

广西贵港野葛蛋白质含量为12.27%，北海野葛蛋白质含量为10.36%，柳州粉葛蛋白质含量为9.34%。在最佳的提取工艺条件下广西北海野葛蛋白质的提取率为58.87%、贵港野葛蛋白质的提取率为83.20%和柳州粉葛蛋白质的提取率为22.27%。同时葛根蛋白的持水率为4.49 g/g、持油率为4.05 g/g、起泡率为6.67%和乳化率为34.88%。

葛根蛋白属于植物蛋白，具有脂肪少和胆固醇低的特点，而且葛根蛋白还具有改善心血管疾病、降低胆固醇和预防慢性疾病的功效。葛根蛋白为豆科蛋白，属于完全蛋白，是完全可以满足人体需求的一种蛋白[20]。研究葛根蛋白的功能性质对于我们合理科学的使用蛋白具有深刻的科研意义，符合当今社会的绿色食品要求。