刺梨预防D-半乳糖诱发小鼠皮肤衰老的作用研究

刘思彤，尹日凤，韦玥吟，夏星，李宇清

（1.广西中医药大学广西高校中药药理重点实验室，广西南宁530200；2.广西中医药大学公共卫生与管理学院，广西南宁530200）

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）为蔷薇科蔷薇属多年生落叶灌木缫丝花的果实，主要出产于我国西南地区及陕西、甘肃、江西、福建、湖北、广西等地，其营养价值高兼有滋补健身之效[1]。果中富含维生素C、多酚、黄酮、有机酸、多糖、氨基酸等成分，现代研究认为刺梨中富含抗氧化活性成分[2-5]，具有较好的调节机体免疫力和延缓衰老的作用[6]。我国传统医学认为“生长壮老已”是机体生理变化的5 个阶段，《素问上古天真论》道：“女子五七，阳明脉衰，六七，面皆焦，发始白。丈夫六八，阳气衰竭于上，面焦，发鬓颁白。”指出人体衰老的最明显外观表现即为皮肤干燥、松弛、皱纹增多等皮肤老化的状态。《灵枢天年》有“七十岁，脾气虚，皮肤枯”的描述，表明皮肤衰老的本质与脾脏直接相关。《中华本草》记载，刺梨归脾、肾、胃经，有滋补强壮的功效，可见刺梨可能通过补益脾脏减轻皮枯面焦[7]。现代医学认为，引起皮肤老化的关键原因是各种因素导致的真皮层和表皮层的氧化应激，因此有强大抗氧化功效的刺梨可能对皮肤衰老进程产生影响。目前关于食用刺梨影响皮肤衰老的作用研究并不多，本文从中西医学的认识出发，在皮下注射D-半乳糖引起皮肤衰老动物[8]中考察了刺梨的影响，科学评价刺梨的抗皮肤衰老作用。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 受试动物

昆明种健康小鼠：SPF 级，雌雄各半，体重18 g～22 g，广西医科大学实验动物中心提供（动物生产许可证号：SCXK 桂 2014-0002）。

1.1.2 材料与试剂

刺梨全果提取物：桂林实力科技有限公司，为刺梨全果浸提物经干燥后所得产品，其中刺梨总酚含量≥8%，多糖含量≥7%，维生素C 含量≥3%。

D-半乳糖：北京索莱宝生物科技有限公司；丙二醛（malondiadehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxidx dismutase，SOD）、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、总蛋白检测试剂盒及羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）：南京建成生物工程研究所；透明质酸（hyaluronic acid，HA）ELISA 检测试剂盒：武汉华美生物工程有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器设备

DT-100 型电子天平：美国双杰兄弟（集团）有限公司；UV1901 型分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；SK-Ⅲ皮肤水分测定仪：深圳市菲斯凯尔电子厂；DM2500 显微镜：德国 Leica 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组及皮肤衰老造模

将小鼠随机分为6 组，每组14 只，分别为正常对照组，模型组，维生素E（0.1 g/kg）阳性对照组，刺梨高剂量组（2 g/kg）、中剂量组（1 g/kg）、低剂量组（0.5 g/kg）。正常对照组皮下注射生理盐水，其余各组小鼠每天1次皮下注射D-半乳糖（1 g/kg），连续6 周，建立亚急性皮肤衰老小鼠模型。在注射D-半乳糖的同时，各组动物灌胃服食相应样品，每天1 次，连续6 周，对照组与模型组灌胃等量的蒸馏水。

1.2.2 皮肤水分测定

实验期间每7 d 采用皮肤水分测试仪测定皮肤水含量1 次，记录皮肤含水百分比。

1.2.3 皮肤及血清抗氧化指标测定

末次灌胃后1 h 处死动物，取血离心分离血清，依照试剂盒方法测定血清MDA、SOD 及T-AOC。

1.2.4 皮肤及血清抗氧化指标测定

小鼠背部皮肤除去皮下脂肪和其他结缔组织，称质量，取9 倍质量的预冷生理盐水制备皮肤匀浆，匀浆液在 4 ℃、3 000 r/min 离心 10 min，取上清液，分别按照试剂盒说明检测皮肤组织中HYP、HA、MDA、SOD及皮肤总蛋白含量。

1.2.5 皮肤组织结构观察

末次给药后1 h 处死动物，剪取肩颈部皮肤放入4%中性多聚甲醛溶液固定，HE 染色后进行皮肤形态的组织学观察。

1.3 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2.1 刺梨对衰老皮肤水分的影响

刺梨对衰老皮肤组织含水量的影响见表1。

造模第一、二周皮肤含水量无明显变化，从第三周起，模型组皮肤含水量逐渐降低。与模型组比，给药组皮肤含水量逐渐升高，至第五周，刺梨高剂量组皮肤含水量显著升高（P＜0.01），且中剂量组升高更为显著（P＜0.001）。至第六周，高剂量组与中剂量组皮肤含水量显著高于模型组（P＜0.05）。表明刺梨能显著改善长期注射D-半乳糖造成的衰老性皮肤水含量下降。

2.2 刺梨对皮肤组织中SOD活力、MDA含量的影响

刺梨对衰老皮肤组织中SOD 活力、MDA 含量的影响见表2。

表1 刺梨对衰老皮肤组织含水量的影响（，n=14）Table 1 Effect of Rosa roxburghii Tratt on moisture content in aging skin tissues

表1 刺梨对衰老皮肤组织含水量的影响（，n=14）Table 1 Effect of Rosa roxburghii Tratt on moisture content in aging skin tissues

注：与模型组比较，* 表示差异显著，P＜0.05；** 表示差异极显著，P＜0.01。

组别剂量/（g/kg）第一周/%第二周/%第三周/%第四周/%第五周/%第六周/%正常 21.86±2.97 23.77±6.55 23.44±3.97 22.45±2.85 22.58±2.36 21.19±2.66模型 22.78±2.11 21.55±2.86 23.16±3.70 21.89±3.49 21.61±2.55 20.99±2.68阳性 0.1 25.76±6.38 22.88±3.23 21.52±4.68 23.28±3.05 23.94±2.61* 23.82±3.20*刺梨高剂量 2 23.08±2.78 23.49±3.67 22.88±2.47 22.96±2.35 25.14±3.42** 23.53±3.05*刺梨中剂量 1 24.23±4.91 22.53±3.81 21.79±1.78 22.12±2.73 25.73±2.57** 24.04±3.73*刺梨低剂量 0.5 22.17±2.05 22.74±4.71 21.08±1.90 24.61±6.70 23.49±3.54 22.80±3.41

表2 刺梨对衰老皮肤组织中SOD 活力、MDA 含量的影响（，n=14）Table 2 Effects of Rosa roxburghii Tratt on SOD activity and MDA content in aging skin tissues

表2 刺梨对衰老皮肤组织中SOD 活力、MDA 含量的影响（，n=14）Table 2 Effects of Rosa roxburghii Tratt on SOD activity and MDA content in aging skin tissues

注：与正常组比较，#表示差异显著，P＜0.05；与模型组比较，**表示差异极显著，P＜0.01。

MDA/（nmol/mg protein）正常 95.45±29.14 1.39±1.78模型 72.68±20.20# 3.47±2.78#阳性 0.1 79.09±19.05 2.20±5.96刺梨高剂量 2 80.33±18.00 1.21±0.38**刺梨中剂量 1 130.54±64.95** 1.15±0.44**刺梨低剂量 0.5 141.15±53.76** 3.06±3.40组别剂量/（g/kg）SOD/（U/mg protein）

与正常对照组相比，模型组皮肤SOD 活力显著降低（P＜0.05）。与模型组比，刺梨中剂量与低剂量组的SOD 活力显著升高（P＜0.01）；高剂量与中剂量组的MDA 含量显著降低（P＜0.01）。这些结果表明刺梨能显著改善D-半乳糖造成的皮肤氧化应激损伤。

2.3 刺梨对皮肤组织中HA、HYP含量的影响

刺梨对衰老皮肤组织中HA、HYP 含量的影响见表3。

表3 刺梨对衰老皮肤组织中HA、HYP 含量的影响（，n=14）Table 3 Effect of Rosa roxburghii Tratt on the content of HA and Hyp in aging skin tissues

表3 刺梨对衰老皮肤组织中HA、HYP 含量的影响（，n=14）Table 3 Effect of Rosa roxburghii Tratt on the content of HA and Hyp in aging skin tissues

注：与正常组比较，#表示差异显著，P＜0.05；与模型组比较，*表示差异显著，P＜0.05。

HYP 含量/（μg/mg protein）正常 175.8±42.0 2.26±0.69模型 115.0±32.3# 1.71±0.22#阳性 0.1 114.7±34.7 1.86±0.22刺梨高剂量 2 151.8±52.3* 1.85±0.34刺梨中剂量 1 153.2±34.9* 1.77±0.22刺梨低剂量 0.5 127.6±25.1 1.78±0.23组别剂量/（g/kg）HA 含量/（ng/mg protein）

较正常对照组，衰老皮肤中HA 含量显著减少（P＜0.05），HYP 含量也显著降低（P＜0.001）；连续服用刺梨高剂量及中剂量后，小鼠皮肤中HA 含量均较模型动物显著增加（P＜0.05）；刺梨组HYP 含量有升高趋势。表明刺梨可能通过增加天然保湿因子HA 的含量，缓解D-半乳糖诱发的皮肤衰老。

2.4 刺梨对血清SOD活力、MDA含量及T-AOC的影响

刺梨对衰老动物血清中SOD 活力、MDA 含量及T-AOC 的影响见表4。

表4 刺梨对衰老动物血清中SOD 活力、MDA 含量及T-AOC 的影响（，n=14）Table 4 Effects of Rosa roxburghii Tratt on serum SOD activity，MDA content and T-AOC in aging mice

表4 刺梨对衰老动物血清中SOD 活力、MDA 含量及T-AOC 的影响（，n=14）Table 4 Effects of Rosa roxburghii Tratt on serum SOD activity，MDA content and T-AOC in aging mice

注：与正常组比较，#表示差异显著，P＜0.05；##表示差异极显著，P＜0.01；与模型组比较，*表示差异显著，P＜0.05；**表示差异极显著，P＜0.01。

T-AOC/（U/mL）正常 139.29±14.98 3.47±0.67 12.34±1.26模型 103.43±24.20## 7.41±2.31## 9.17±1.72##阳性 0.1 98.95±27.27 4.24±2.88 12.93±1.64**刺梨高剂量 2 128.88±24.58# 6.03±1.62* 18.23±2.19**刺梨中剂量 1 107.70±20.93 5.80±1.48* 21.66±1.51**刺梨低剂量 0.5 104.48±17.81 8.91±2.23 21.66±2.53**组别 剂量/（g/kg）SOD/（U/mL）MDA/（nmol/mL）

与正常对照组相比，模型组血清中SOD 的活力显著降低（P＜0.001），T-AOC 显著下降（P＜0.001），MDA积累量显著增加（P＜0.001）。刺梨高剂量能显著升高血清SOD 活力和 MDA 含量（P＜0.05），并且 3 个剂量的刺梨均能显著增强血清T-AOC（P＜0.001）。这些结果表明刺梨能改善D-半乳糖造成血液中的氧化应激损伤。

2.5 刺梨对小鼠皮肤组织结构的影响

刺梨对皮肤老化小鼠皮肤厚度及毛囊数的影响见表5，刺梨对小鼠皮肤组织结构的影响HE 染色图见图1。

表5 刺梨对皮肤老化小鼠皮肤厚度及毛囊数的影响（，n=14）Table 5 Effects of Rosa roxburghii Tratt on skin thickness and hair follicles in aging mice

表5 刺梨对皮肤老化小鼠皮肤厚度及毛囊数的影响（，n=14）Table 5 Effects of Rosa roxburghii Tratt on skin thickness and hair follicles in aging mice

注：与正常组比较，#表示差异显著，P＜0.05；与模型组比较，*表示差异显著，P＜0.05。

组别 表皮厚度/μm 真皮厚度/μm 皮肤总厚度/μm 毛囊数/个正常 18.26±3.97 330.16±171.55 349.42±170.45 20.27±10.73模型 21.02±3.46# 229.32±127.24 287.35±127.77 18.13±13.95阳性 15.68±2.87 219.93±26.01 235.62±26.78 11.20±3.03刺梨高剂量 19.62±3.31 245.46±98.87 265.08±98.51 23.80±12.64刺梨中剂量 18.71±2.33* 249.84±132.17 268.55±131.49 16.38±10.94刺梨低剂量 19.71±3.19 372.70±161.07 392.42±159.39 22.31±8.55

图1 刺梨对小鼠皮肤组织结构的影响HE 染色图Fig.1 HE staining of the effect of Rosa roxburghii Tratt on skin structure in aging mice

HE 染色结果显示，正常对照组小鼠皮肤各层结构完整，皮下毛囊、皮脂腺饱满，表皮规则，表皮与真皮界线清晰。模型组表皮不规则，基膜界线不明显，真皮皱缩变薄，皮肤附属器均有不同程度的减少。刺梨低剂量组皮肤略增厚，皮肤结构完好，可见较多毛囊、皮脂腺。中剂量组皮肤组织未见明显改善。刺梨高剂量组皮肤附属器明显增加。

3 结论

现代医学对于皮肤衰老主要采用防晒、抗氧化剂、维甲酸类、雌激素类以及局部消除皱纹等方法作为防治手段[9-10]，但这些防治措施并不能真正地延缓皮肤衰老。在日常饮食中增加富含抗氧化成分的天然果蔬[11]，以延缓皮肤衰老的防治方法越来越受人们的关注。

衰老过程分为自然衰老和光老化，氧化损伤是皮肤衰老的重要因素。在机体自然衰老的过程中，氧自由基清除能力下降，氧自由基不断累积，机体出现氧化应激，皮肤也会随之衰老。光老化主要是机体在生活过程中受到紫外线的过度照射，使得皮肤中的氧自由基大量聚集，SOD 等氧化酶清除速度远不及对因紫外线刺激而产生的氧自由基累积速度，所以紫外线可以使皮肤在短时间发生衰老，可致皮肤细胞衰老或细胞过早死亡甚至癌变[12]。总而言之，自由基的积累是皮肤衰老的重要因素。当机体的自由基增加时，羟脯氨酸（HYP）发生交联、降解，从而影响胶原蛋白的结构，使之发生断裂，皮肤的弹性随之降低，同时变得干燥[13]。而透明质酸（HA）是存在于真皮中的保湿剂，可锁住肌肤水分，保持皮肤润泽，延缓皮肤衰老[14]。衰老小鼠服用刺梨后，皮肤水分含量增多，皮肤组织中HA含量显著增高，皮肤厚度较模型小鼠增厚，皮肤组织HYP 含量也呈上升趋势，提示刺梨对皮肤的干燥、粗糙等有一定的治疗作用。

此外，皮肤总抗氧化能力（T-AOC）作为一种非酶促抗氧化剂，也间接地反映了氧化应激水平，可以衡量机体的抗衰老指数[15]。SOD 是抗氧化体系中最重要的抗氧化酶，能有效对抗超氧自由基引起的氧化损伤[16]，提高SOD 活力可以发挥其抗衰老的作用。此外，ROS 水平的升高会导致脂质过氧化，而生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化会导致MDA 的形成。MDA 作为脂质过氧化的主要标志，其含量的增加表明，随着老化进程的延长，过氧化损伤程度增加[17-18]。皮肤衰老小鼠经过刺梨提取物治疗后，皮肤和血清的MDA 含量显著降低，T-AOC、SOD 含量显著增加，提示刺梨具有抗氧化作用。曹晶晶等[19]利用刺梨多糖在正常KM 小鼠的研究中发现刺梨多糖具有良好的抗氧化和抗疲劳作用，与本实验的结果相似。本课题组在前期的研究也表明刺梨多糖能够提高小鼠的抗疲劳能力和耐缺氧能力[20]。

总而言之，刺梨对D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠能增加皮肤水分含量，有效改善皮肤干燥、松弛、粗糙的情况；同时增加HA、HYP 以及T-AOC 含量，可有效延缓衰老；降低MDA 含量，增加SOD 含量，表明其抗衰老机制可能与通过抑制活性氧ROS 诱导的脂质过氧化作用有关。