抗生素抗性基因在生活及工业混合废水处理系统中的分布和去除

姚鹏城，陈嘉瑜，张永明，温东辉，陈吕军,*

1. 上海师范大学环境与地理科学学院，上海 200234 2. 清华大学环境学院，北京 100084 3. 北京大学环境科学与工程学院，北京 100871

自1929年英国细菌学家弗莱明发现青霉素至今，抗生素在医学领域发挥着不可替代的重要作用，然而日益严重的细菌耐药问题，成为21世纪威胁人类健康的重要因素之一[1]。在国际上，抗生素和抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)已经被认为是新兴的环境污染物[2]。据统计，2013年中国抗生素年使用量达到16.2万t，约占世界用量的1/2，同年约有超过5万t抗生素被排放进入环境[3]。研究表明，受人类活动影响的环境表现出更高丰度的抗生素抗性细菌(antibiotic resistance bacteria, ARB)和ARGs[4]。目前大量研究表明ARGs广泛存在于自然水土环境中[5]，如河流[6-8]、湖泊[9]、土壤[10]乃至海洋[11-12]。污水处理厂(wastewater treatment plants, WWTPs)汇集了人类生活、生产中的大量污水[13]，其污水、污泥被认为是环境中抗生素抗性基因的主要人为污染源[14-16]，并且污水中丰富的营养物质和大量的微生物为ARGs的增殖和传递提供了便利条件[17]。由于废水处理工艺的不同，ARGs的分布受到影响，去除效果也各不相同[16,18-19]。以往的研究主要集中在进水和出水上，缺乏分析处理生活及工业混合污水的不同工艺对ARGs分布的影响[20-21]，近年来污水处理不同工艺对ARGs分布影响的研究不断增多[5,19]。为了更好地评价废水处理系统中不同工艺去除ARGs的效果，强化ARGs的去除，降低ARGs释放进入环境，近年来考察废水处理系统不同工艺对ARGs的作用及去除成为研究焦点[22-23]。

本研究选择浙江某污水处理厂为研究对象，该厂进水中生活污水占30%，工业废水占70%，主要为化工、印染和造纸等废水。选取厂内2套不同的处理工艺，沿各工艺流程采集污水及泥水混合物，对其中8类共24种ARGs进行定性检测，并对其中7种ARGs、一类整合子及16S rDNA进行定量检测，分析ARGs在2套工艺流程中的分布特征以及对比2套工艺对ARGs的去除效果。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 样品采集及预处理

样品采集于2018年4月，该污水处理厂的2套工艺流程、采样点如图1所示，图1(a)为工艺一(P1)的流程，处理水量15万m3·d-1，主要技术为厌氧-缺氧-好氧处理(A2/O)和膜生物反应器(MBR)；图1(b)为工艺二(P2)的流程，处理水量30万m3·d-1，主要技术为氧化沟和二沉池。

采样点包括：进水(1-Inf和2-Inf)、MBR出水(1-Eff)、二沉池出水(2-Eff)、生物处理单元不同区段的泥水混合物(1-An、1-Ax、1-Ox和2-An、2-Ax、2-Ox)，以及二沉池剩余污泥(2-WS)。每个采样点采集了1 L样品，水样存放于预先清洗干净的无菌聚乙烯塑料瓶中，泥样存放于预先清洗干净的铝盒中，冷藏运输，回到实验室后水样置于4 ℃保存，泥样置于-20 ℃保存。

1.2 样品DNA提取

以0.22 μm混合纤维素酯滤膜(Millipore，德国)过滤样品，再使用PowerSoil DNA Isolation Kit(Mo Bio，美国)试剂盒对滤样提取DNA。使用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳(DYCP-31DN，北京六一)和NanoDrop 2000超微量分光光度计(Thermo Fisher，美国)对所提DNA纯度和浓度进行检测。

1.3 PCR检测

图1 废水处理系统2套工艺流程和采样点示意图Fig. 1 Two treatment processes and sampling points of the wastewater treatment plant

1.4 定量PCR(qPCR)检测

根据PCR定性检测的结果，本研究对tetC、tetW、sulΙ、sulⅡ、dfrA1、dfrA13和floR共7种ARGs、一类整合子intI1及16S rDNA进行定量测定。采用SYBR Green I方法，使用实时荧光定量PCR仪(BioRad CFX96 Touch，美国)对各目标基因进行定量测定。qPCR采用20 μL体系，包含10.0 μL SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，中国)，引物各0.4 μL，DNA模板1 μL及ddH2O 8.2 μL。反应程序为：95 ℃预变性1～2 min；95 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环[5]。溶解曲线程序为55～95 ℃，每0.5 ℃读数一次，期间停留30 s。测定时，将标准质粒以10倍梯度稀释，再根据质粒浓度计算得到标准质粒的拷贝数，与通过实时荧光定量PCR测定得到的Ct值，可绘制出标准曲线，标准质粒的构建方法参照张衍等[24]的研究。各目标基因标准曲线的线性相关系数在0.990～0.996之间。每个样品均设置3个平行样。

2 结果(Results)

2.1 进水中的ARGs

2.2 污水处理厂2套工艺中ARGs的分布特征

根据表1的结果，对全部样品中7种ARGs及intI1、16S rDNA进行定量分析。进水中目标基因的分析结果如图2所示。

该污水处理厂P1与P2进水中ARGs的绝对丰度处于同一水平，说明在P1与P2进水中的ARGs对总ARGs的贡献是相同的。绝对丰度最高的为intI1，P1、P2进水中intI1的绝对丰度为1.88×106、7.76×105copies·mL-1，intI1在污水中较稳定[27]，而后绝对丰度依次递减的是sulⅠ、tetC、sulⅡ、tetW、dfrA1、floR和dfrA13，这些ARGs的绝对丰度为8.15×103～9.84×105copies·mL-1。与其他多次出现在文献报道中的抗性基因不同，甲氧苄啶类抗性基因鲜有文献报道，dfrA1、dfrA13在2套工艺流程中均被检出，表明现阶段对污水处理厂ARGs分布状况的评估有待改进。

2套工艺中目标基因沿处理流程的变化情况如图3所示。在样品中，16S rDNA的绝对丰度为1.74×104～3.0×108copies·mL-1，在A2/O工艺段和氧化沟工艺段样品中16S rDNA的绝对丰度均高于进水与出水的绝对丰度，说明了微生物在生物处理单元得到了大量增殖，且在其后得到了有效分离[5]。

同时在该废水处理系统的剩余污泥(2-WS)中，也检测了各ARGs的分布状况，如图4所示，剩余污泥中各ARGs中磺胺类抗性基因绝对丰度最高，sulΙ、sulⅡ分别达到了1.79×108、9.96×107copies·g-1，然后依次为tetW、tetC、dfrA1、floR和dfrA13，绝对丰度分别为3.41×107、7.03×106、9.38×105、1.59×105和5.93×104copies·g-1，与进水中的ARGs相比，剩余污泥中的ARGs绝对丰度要高得多。有报道指出，WWTPs污泥中ARGs的分布在105.69～1011.32copies·g-1绝对丰度水平[28]。在生物处理过程(A2/O、氧化沟)中去除ARGs，是由于活性污泥的吸附及其沉淀[29]，导致ARGs在剩余污泥中不断的积累，致使剩余污泥中的ARGs绝对丰度高于进水中ARGs的绝对丰度。目前中国大部分污水处理系统的剩余污泥通过脱水填埋处理，而剩余污泥中大量ARGs通过渗滤液释放到泥土中，如果没有妥善处理这些污泥的方法，势必导致抗生素耐药性基因向环境快速迁移和扩散。有文献报道，剩余污泥对环境中ARGs的释放比污水贡献更大[15]。

2.3 污水处理系统中2套工艺对ARGs的去除效果

如图5所示，P1处理效果明显优于P2处理效果，其中，在P1中去除效果最佳的是四环素类tetC和tetW，去除效果达到3.88和3.86个数量级，而去除效果最差的是dfrA1，绝对丰度仅下降2.03个数量级，与P2的去除效果一致。而P1与P2的区别在于P1工艺有MBR工艺分离泥水混合物，P2工艺是二沉池通过重力作用分离泥水混合物，结果表明，MBR工艺对污水中大部分AGRs去除效果均好于二沉池工艺对ARGs的去除。从图5可知，P2去除ARGs的效率依次为tetW、dfrA1、dfrA13、floR、tetC、sulΙ和sulⅡ，研究表明，磺胺甲恶唑耐药菌难以去除[29]，这解释了去除磺胺类抗性基因效果不佳的原因。

图2 2套工艺进水中的目标基因绝对丰度Fig. 2 Absolute abundances of target genes in the two influents

图3 2套废水处理系统中ARGs和16S rDNA的分布Fig. 3 Abundance of ARGs and 16S rDNA in the two treatment processes

3 讨论(Discussion)

研究发现，该污水厂的2套工艺中，污水从沉砂池进入厌氧池或氧化沟的厌氧区时，tetC和tetW基因绝对丰度呈现下降趋势，dfrA13和floR抗性基因绝对丰度显著下降，分别下降了1.34和1.12个数量级。磺胺类抗性基因(sulΙ、sulⅡ)绝对丰度呈现不同程度的上升趋势，而后抗性基因的绝对丰度趋于稳定。16S rDNA基因的绝对丰度与磺胺类抗性基因绝对丰度的分布规律相似。在污水处理系统中，一类整合子和磺胺类抗性基因绝对丰度高于其他类抗性基因[28]，由于sulΙ、sulⅡ等磺胺类ARGs位于可传递单位(如intI1)上，磺胺类抗性基因具有很大的转移能力[5]，而tetW为编码核糖体保护蛋白的四环素类ARGs，不利于传递、转移。

图4 剩余污泥中ARGs绝对丰度分布Fig. 4 Abundance distribution of ARGs in sludge

图5 2套工艺对ARGs、intI1和16S rDNA的去除(以基因拷贝数的对数计)Fig. 5 Removals of ARGs, intI1 and 16S rDNA by the two processes (Logarithm of gene copy number)

表1 废水处理厂2套工艺进水中抗生素抗性基因(ARGs)检出情况Table 1 Presence of antibiotic resistance bacteria (ARGs) in the influents of the two processes in the wastewater treatment plant (WWTP)

注：+表示检出，-表示未检出；*表示定量检测ARGs。

Note: + means check out; - means not detected;*means quantitative detection of ARGs.

P1工艺进水(总ARGs为3.89×106copies·mL-1)到出水(总ARGs为2.56×103copies·mL-1)的总ARGs的绝对丰度显著下降，P2工艺进水(总ARGs为1.77×106copies·mL-1)到出水(总ARGs为6.67×104copies·mL-1)的总ARGs的绝对丰度下降程度比P1工艺小，表明P1工艺对ARGs的去除效果比P2工艺好。

该污水处理厂的P1工艺与P2工艺的出水合并，共同排入临近海域。而P2的出水ARGs绝对丰度则比P1出水中的ARGs绝对丰度高1.34～1.90个数量级，结合P1、P2工艺的处理量，得出P2工艺中ARGs的排放通量分别为tetC(2.07×1015copies·d-1)、floR(6.67×1013copies·d-1)、dfrA13(1.31×1013copies·d-1)、sulⅡ(1.94×1015copies·d-1)、tetW(1.37×1014copies·d-1)、sulΙ(5.18×1015copies·d-1)和dfrA1(5.84×1013copies·d-1)，P2工艺ARGs的排放通量对总排水ARGs的排放通量的贡献分别是tetC(98.7%)、floR(97.2%)、dfrA13(96.5%)、sulⅡ(96.1%)、tetW(95.8%)、sulΙ(95.6%)和dfrA1(43.5%)，说明前6种基因P2出水对总出水的贡献远远大于P1出水对总出水的贡献。但是dfrA1基因在2套工艺中最终出水ARGs的排放通量一致，说明2套工艺中dfrA1基因对最终出水中dfrA1基因排放通量的贡献是一致的。

传统的活性污泥法去除ARGs以及intI1的主要途径是活性污泥吸附水中的ARGs，而后通过固液分离去除，与传统的活性污泥法相比，MBR工艺能更有效地降低ARGs。传统工艺A2/O、厌氧好氧工艺法(A/O)和氧化沟的去除效果均没有MBR工艺好[30]。在本研究中，只考虑细胞内ARGs的基础上，MBR工艺能捕获水中所有直径0.22 μm以上的悬浮颗粒，去除水中的ARGs，但MBR出水中依然可以检测到所有种类的ARGs，这可能是由于固液分离不完全造成的，比如膜组件中纤维的断裂等[31-32]。本研究中，P1为A2/O工艺和MBR工艺，P2为氧化沟工艺，2套工艺对ARGs的去除效果与文献结果一致。绝对丰度高的ARGs(sulΙ、tetC、sulⅡ和tetW)在MBR工艺中与16S rRNA呈现显著相关(P<0.01)，高丰度的ARGs与微生物量密切相关，说明固液分离是去除ARGs的主要途径之一。不同工艺最终致使固液分离的程度不同，MBR工艺的固液分离效果远优于二沉池的重力沉降，所以MBR工艺对ARGs的去除效果优于氧化沟。但是dfrA1基因的去除效果在不同固液分离程度的工艺中并没有呈现明显的差别，有待深入研究。

污水处理厂的最终出水排入临近海域，可能引起ARGs的传播，影响海域内的生态[5]。此外，无论是MBR工艺还是氧化沟工艺，ARGs通过活性污泥吸附，固液分离而被去除，但却在污泥中富集。为彻底将ARGs去除，需在污水处理和污泥处置两方面探索新技术和工艺，控制ARGs的产生和传播风险。