柴胡疏肝汤对癫痫大鼠miRNA132、NF-kB表达的影响

何乾超 林洁洁 高玉广 张志伟 黄德庆 张元侃 刘永辉 陈 炜

广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023

癫痫是脑部组织神经元异常放电导致中神经系统功能短暂失常的疾病，临床症状以反复发生抽搐及短暂意识变化为主，是一种常见的神经系统疾病。目前全世界约有五千万癫痫患者，其中90%的患者在发展中国家。中国癫痫患病率为4‰～7‰，其中活动性癫痫患病率为4.6‰[1]。许多癫痫患者主要是采取药物治疗控制，但还有高达30%患者反复发作、病情难控制，严重干扰着患者的生活及工作[2]。癫痫神经元高兴奋性与癫痫形成过程中的炎性反应和炎症介质密切相关，尤其是核因子kB(NF-kB)途径，NF-kB进入细胞核，然后再与相应靶序列接合，控制靶基因的转录活性，NF-kB参加炎症反应、免疫调节、细胞凋亡等过程，与癫痫密切相关[3]。研究发现，miRNA能使癫痫患者神经元突触周围蛋白质异常表达进而诱导癫痫发作[4]。miRNA132表达与癫痫的发生、发展密切相关，miRNA132上调可提高神经元兴奋性，且调节过表达的miRNA132可减轻癫痫的痫性发作，但是目前尚缺乏中医药对关键因子调控miRNA132的研究[5]。

《黄帝内经》中对“癫痫”的记载，认为癫痫发作与肝失疏泄，气机逆乱关系密切，其发病原因也不离风、火、痰、食，基本的发病病机为痰涎雍滞、迷闭孔窍，痰在癫痫的发病中起非常重要的作用。因此，治疗上常以化痰解郁，疏肝理气为治法。柴胡疏肝汤出自《景岳全书》，是疏肝理气的经典方。柴胡疏肝汤组成由柴胡、香附、白芍、川芎、枳壳、陈皮、甘草组成，功效是疏肝行气，活血止痛。方中柴胡功善疏肝解郁，使肝木条达，现代药理研究证实柴胡具有疏肝解郁、镇痛、消炎、镇静等抑制中枢的作用；香附理气疏肝而止痛，川芎活血行气以止痛，二药相合，助柴胡以解肝经之郁滞，并增行气活血止痛之效，共为臣药；陈皮、枳壳理气行滞，芍药敛阴柔肝，甘草养血柔肝，缓急止痛，调和诸药，为使药；诸药相合，共奏疏肝行气、活血止痛之功。李华霞[6]等对柴胡疏肝汤治疗癫痫进行了系统评价，发现柴胡疏肝汤加味具有明显的抗癫痫作用。我们认为痫病的病机与肝的疏泄功能异常关系密切，其风、痰、癖产生均为肝气失于疏泄、条达的病理变化，提出了“从肝论治”，运用加味柴胡疏肝汤(柴胡 12 g、陈皮 12 g、川芎 9 g、炒枳壳 9 g、芍药 9 g、香附 9 g、炙甘草 6 g、浙贝母 12 g)治疗癫痫。前期的临床研究发现，使用柴胡疏肝汤治疗能够明显减少患者痫性发作的频次，改善了患者脑电图变化，增强治疗的效果[7-9]。实验研究发现，加味柴胡疏肝汤能够升高miRNA-204的表达，减少神经元细胞过度自噬，保护神经功能从而达到治疗癫痫的作用[10]。柴胡疏肝汤还可以通过调节外周色氨代谢产物及癫痫小鼠色氨酸代谢通路治疗癫痫[11]。柴胡疏肝汤干预不同靶点及信号通路能减少癫痫的发作次数，随着miRNA作为癫痫的生物标志物开始被重视，对miRNA的作用靶点及涉及的信号通路进一步深入探讨研究，将研究出更多作用在这些靶点的药物从而根本上减少及抑制癫痫发作，减轻癫痫发作对人体生理病理引起的损伤。本实验结合前期基础，运用柴胡疏肝汤对癫痫大鼠模型进行干预治疗，观察柴胡疏肝汤对癫痫大鼠miRNA132的影响，从而探讨柴胡疏肝汤治疗癫痫与调控miRNA132表达的关系。

1 材料与方法

1.1 试验动物 清洁级雄性SD大鼠120只，年龄3～4个月，体重170～210 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司供应，动物许可证号：SCXK(沪)2012-0002，动物合格证号：2015000536122。所有大鼠在室温(23～25 ℃)，湿度为45%～55%，光照12 h/d，自由进水进食，经过7d时间的适应后进行试验。

1.2 药物、试剂 柴胡疏肝汤由柴胡12 g、陈皮12 g、川芎9 g、炒枳壳9 g、芍药9 g、香附9 g、炙甘草6 g、浙贝母12 g按比例调配，中药由广西中医药大学第一附属医院提供，中药制剂室煎煮浓煎至1g/mL，放于4℃冷藏备用。卡马西平片(上海福达制药有限公司)，氯化锂(批号：310468，国药集团化学试剂有限公司)，匹罗卡品 (天津金耀氨基酸有限公司)，硫酸阿托品注射液(北京双鹤药业股份有限公司)，地西泮注射液(天津药业焦作有限公司)，RNAwait非冻型组织RNA保存液(批号：SR0020，Solarbio)， Trlzol Reagent (批号：184608，Ambion)，SYBR Green qPCR Mix (批号：140321，Monad)，MonScript RTIII all-in-one Mix(批号：RN05004S，Monad)。

1.3 仪器 AR2140电子分析天平(OHAUS)，5417R高速冷离心机(Thermo Multiskan公司)，ABI7600定量PCR仪器(美国LIFE公司)。

1.4 模型制备 造模方法参考Cell Reports杂志报道的以腹腔注射氯化锂溶液联合盐酸匹罗卡品这种化学点燃方法[12]为主，先对实验大鼠向腹腔注射氯化锂溶液127 mg/kg，20 h后再注射匹罗卡品50 mg/kg(处理前30 min先给予硫酸阿托品注射液1 mg/kg以对抗匹罗卡品所致的外周性的胆碱能反应)，匹罗卡品注射后参照Racine分级标准[13]观察大鼠行为学变化，0级：没有抽搐发作；1级：存在有面部痉挛；2级：存在有面部痉挛和规律性的点头；3级：存在有面部痉挛和规律性的点头、一侧前肢阵挛；4级：存在有面部痉挛、规律性的点头、双前肢发生阵挛、后肢站立；5级：存在有面部痉挛、规律性的点头、双前肢发生阵挛、后肢站立、跌倒。达到4～5级并进入癫痫持续状态(SE)的大鼠为癫痫诱导成功；没有发作或没有达到 4级的大鼠不纳入本研究。如果癫痫状态持续达1 h，则采取注射地西泮10 mg/kg 终止发作。癫痫持续状态后的大鼠度过急性期24 h后，进入潜伏期(10 d)，在潜伏期，每天采用5%的葡萄糖氯化钠注射液5 mL注射，2次/d，潜伏期后进入慢性期。癫痫持续状态后，用监控视频系统连续记录。每个鼠笼放置八只大鼠，用苦味酸进行记号，检测时间24 h，观察时期为慢性期的四周。

1.5 动物分组及给药 实验大鼠适应性喂养1周后，随机分为①癫痫组(n=72)，②假手术组(n=24)，③空白组(n=24)，癫痫组采用上述方法进行造模，空白组无需任何处理，假手术组仅用腹腔注射生理盐水造模。造模成功后，将72只模型大鼠随机分为 3 组，分别是模型组、中药组、西药组。中药组给予柴胡疏肝汤水煎剂灌胃给药，西药组给予卡马西平片，其余各组给予同等量的生理盐水灌胃，以2 mL/100 g 体重灌胃给药，每日 1 次，灌胃的时间为4 周。

1.6 取材及组织处理 用10%水合氯醛(剂量10mg/kg)，腹腔注射麻醉各组大鼠，然后以仰卧位，将其四肢固定于解剖硬板上，打开胸部，暴露心脏后，将灌注有生理盐水针头插入左心室，把右心耳剪掉，与此同时，快速灌注生理盐水，随即，进行断头取脑，继续用生理盐水冲去残余血液，在大脑中下三分之一交界处，剥离出双侧海马组织，与此同时，剥开颞叶皮层，放置于RNA保护液中，再放入-80℃冰箱中保存。

1.7 观测指标与方法

1.7.1 痫性发作行为记录 24 h监测大鼠痫性发作行为改变，参照Racine分级标准(0级：没有抽搐发作；1级：存在有面部痉挛；2级：存在有面部痉挛和规律性的点头；3级：存在有面部痉挛和规律性的点头、一侧前肢阵挛；4级：存在有面部痉挛、规律性的点头、双前肢发生阵挛、后肢站立；5级：存在有面部痉挛、规律性的点头、双前肢发生阵挛、后肢站立、跌倒)观察大鼠行为学变化进行评分。

1.7.2 miRNA-132 、NF-kB的 mRNA 的PCR 检测 提取总 RNA，扩增 mRNA，再逆转录为 cDNA，应用 PCR 方法对NF-kB、miRNA-132的 mNRA 水平进行检测。记录每个反应管中标本的Ct值，实验结果采用2-△△CT法进行分析。△CT=目的基因CT值-内参基因CT值。

2 结果

2.1 各组痫性发作情况 由表1可知，空白组和假手术组无痫性发作，模型组1～4周的痫性发作级别数值无变化，西药组和中药组的痫性发作从1～4周逐次减少。第1周，模型组与中药组的痫性发作级别数值无变化(P>0.05)，西药组的痫性发作级别数值低于模型组 (P<0.05)。第2～4周，中药组的痫性发作级别数值均低于模型组(P<0.05)，西药组的痫性发作级别数值均低于中药组(P<0.05)。

表1 各组大鼠痫性发作级别数值比较

注：与同期模型组比较，ΔP<0.05；◆P<0.05，◇P<0.05，●P<0.05；与同期中药组比较，▽P<0.05，▲P<0.05，▼P<0.05。

2.2 miRNA132、NF-kB的mRNA表达 由表2可知，空白组和假手术组的miRNA132表达无差别(P>0.05)，模型组的miRNA132表达低于假手术组(P<0.05)，中药组的miRNA132表达高于模型组(P<0.05)，西药组的miRNA132表达高于中药组(P<0.05)。空白组和假手术组的NF-kB表达无差别(P>0.05)，模型组的NF-kB表达高于假手术组(P<0.05)，中药组的NF-kB表达低于模型组(P<0.05)，西药组的NF-kB表达低于中药组(P<0.05)。

表2 各组实验大鼠miRNA132、NF-kB的mRNA△CT数值比较

注：与假手术组比，ΔP<0.05、◆P<0.05；与模型组相比，◇P<0.05、▽P<0.05；与中药组相比，▼P<0.05、●P<0.05。

3 讨论

癫痫最早在《黄帝内经》中记载，称“羊角风”、“羊痫风”等，中医归属于“痫病”的范畴。痫病的病因病机与肝失疏泄密切联系，其风、火、痰的产生均为肝气失于疏泄、条达的病理变化，“从肝论治”痫病尤为重要。柴胡疏肝汤是疏肝理气的常用方，在“从肝论治”的理论下运用柴胡疏肝汤治疗癫痫，取得了明显的疗效，但是对于柴胡疏肝汤治疗癫痫的分子机制上不清楚，故值得我们进一步探究，为临床上治疗癫痫提供理论依据。

癫痫是神经内科常见的疾病之一，其发病机制目前尚未清楚，大多数癫痫患者经过规范药物治疗后，病情可以得到较好的控制，但仍有少部分患者反复发作、难以控制。因此，寻找新的治疗方式或药物来更好地改善癫痫患者症状，提高治疗有效率尤为迫切。miRNA在中枢神经系统中表达较丰富，参与调控基因表达，与癫痫发生的大脑的神经病理改变有着密切，并且miRNA可以作用于多个靶点来调控多条蛋白通路的基因表达。研究表明，生物体内的细胞中有超过60%的蛋白表达是通过miRNA调控的[14]。以miRNA132作为癫痫基因表达调控的靶点时，在癫痫发作后，miRNA132可以减少癫痫发作诱导的神经元坏死[15]。神经元电活性调节后的miRNA132，在神经元发育及神经突触重塑方面中发挥着重要作用，且癫痫发作的关键原因是神经元电活性兴奋异常增高[16]。NF-kB是细胞中较为重要的一种转录调节因子，可调节免疫及炎症反应，并且在细胞的生长过程和凋亡反应起着重要的作用，是免疫反应的主要调节因子[17]。研究证实NF-kB在神经元变性中起着重要的作用，是通过直接作用于神经元本身的基因表达和间接调节胶质细胞的基因表达来实现[18]。本实验通过对miRNA132和NF-kB表达进行干预后，探讨柴胡疏肝汤是否通过调控miRNA132、NF-kB转录因子对神经元电兴奋性产生影响，发现柴胡疏肝汤可以减少癫痫患者癫痫发作频率和持续时间，减轻脑组织的损伤及还可以改善癫痫模型的异常[6-11,19-23]。

实验结果显示，癫痫模型建立后，模型组miRNA132表达开始降低，NF-kB表达升高，痫性发作的次数增多，miRNA132、NF-kB与癫痫的发生发展密切相关，中药组经过柴胡疏肝汤干预后，痫性发作的次数减少，海马中神经元中检测出的miRNA132与模型组相比明显升高，同时NF-kB表达降低，说明柴胡疏肝汤可以通过调控miRNA132来降低神经元兴奋性，同时下调NF-kB表达，来减少癫痫的发作频率。

综上所述，柴胡疏肝汤可以上调癫痫大鼠海马miRNA132表达，减少NF-kB表达，减少癫痫大鼠的痫性发作，miRNA132、NF-kB是治疗癫痫的作用靶点之一，为今后研究治疗癫痫的新药开发提供实验依据。