一种胰蛋白酶亲和材料的制备及应用

高柳芳，李晨*

山西大学生命科学学院（太原 030006）

胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白水解酶，分子质量在20～30 kDa范围内，专一水解碱性氨基酸如精氨酸及赖氨酸羧基形成的肽键，不仅能够消化普通蛋白质，还可以激活胰脏中的其它蛋白酶原，如胰凝乳蛋白酶原、羧肽酶原、弹性蛋白酶原、磷脂酶原等[1]。作为一种非常重要的专一性消化酶，胰蛋白酶被广泛应用于食品、医药、畜牧和现代生物技术等领域[2-4]。食品加工中作为酶制剂主要用于焙烤[5]、肉类嫩化和组织蛋白的水解[6]等。临床上常用于治疗脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等产生的局部水肿、血肿及脓肿等，还可用于治疗毒蛇咬伤[7]。生物技术领域中主要用于蛋白质的氨基酸序列分析及动物细胞培养前对组织的消化处理等[8]。胰蛋白酶的应用日益广泛，对其制备方法的研究也成为当前的一个热点。目前，常用的蛋白酶分离纯化方法有硫酸铵沉淀法、有机溶剂分级、离子交换层析、凝胶过滤等。然而这些方法的特异性比较低，通常需要综合多种方法才能达到纯化的目的，存在操作繁琐、时间较长等一系列问题，而且由于操作时间长，还可能对酶活性造成不同程度的破坏[9-10]。因此，建立一种简便、快速、高效分离纯化胰蛋白酶的方法显得尤为重要。

亲和层析是利用生物大分子的生物学特异性（如酶与酶抑制剂），即生物分子间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。与其他纯化方法相比，亲和层析具有高效、迅速的优点，有时仅一步即可达到纯化的目的。将酶抑制剂固定化做成亲和层析材料特异吸附纯化对应的酶是一种有效可行的方法[11]。然而，亲和层析配体需满足非特异性吸附低、纯度高、亲和作用力强、稳定性好等特点，寻找合适的抑制剂是制备酶亲和材料的首要关键问题。荞麦胰蛋白酶抑制剂（Buckwheat trypsin inhibitor，BTI）是从荞麦种子中提取出的一种胰蛋白酶的竞争型抑制剂。课题组通过基因工程技术获得了重组BTI，对其活性位点、空间结构及理化性质已进行了详尽研究。BTI由69个氨基酸组成，分子质量为7.9 kDa，具有很高的耐热性及酸碱稳定性，100℃处理60 min对胰蛋白酶的抑制作用仍可保留在80%以上[12-14]。BTI良好的稳定性及对胰蛋白酶较强的抑制作用适于固定化反应，能够用于制备亲和层析介质。

试验选用溴化氰活化的琼脂糖凝胶作为载体，将其与配基BTI偶联制备成亲和层析吸附剂，并进一步研究BTI亲和层析介质用于纯化胰蛋白酶的作用条件，实现一步层析得到高纯度胰蛋白酶的目的，为今后大规模制备胰蛋白酶及开发新型胰蛋白酶提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与设备

胰蛋白酶、C N B r 活化琼脂糖凝胶（C N B r- Sepharose CL-4B）购于生工生物工程（上海）股份有限公司；牛血清白蛋白、考马斯亮蓝R-250购于北京索莱宝科技有限公司；苯甲酰-DL-精氨酰-对硝基苯氨（BApNA）为美国Sigma产品，其余试剂为分析纯。

恒温水浴锅，北京市长风仪器仪表公司；蛋白质纯化系统，美国BIO-RAD公司；TU-1810紫外分光光度计，上海美铺达仪器有限公司；HC-2518R高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；BSA224S精密电子天平，德国Sartorius公司；PB-10精密pH计，德国Sartorius公司；恒温振荡培养箱，上海博讯实业有限公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 重组蛋白BTI的制备

向液体LB培养基（含50 μg/mL Kan和100 μg/mL Kan）中接入含有pQE30-BTI的E.coliBL21（DE3）菌种，于37℃，180 r/min振荡培养至对数生长期，加入诱导剂IPTG（终浓度为0.5 mmol/L），继续振荡培养4 h，以8 000 r/min离心收集菌体。用Tris-HCl缓冲液（20 mmol/L，pH 7.3）将菌体洗涤三次，用相同Tris-HCl缓冲液将菌体重悬，在冰浴条件下超声破碎，直至菌体悬浮液由黏稠变为透亮。将破碎的菌液在80℃加热30 min，然后以12 000 r/min离心10 min，取上清，即得BTI粗蛋白。

重组蛋白BTI带有6×His标签，采用亲和层析法纯化，在蛋白纯化系统（美国BIO-RAD）上进行，检测280 nm处吸光度，流速控制为1 mL/min。用缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，pH 7.5）平衡Ni2+-NTA亲和层析柱，将表达的菌体粗蛋白用0.22 μm滤膜过滤后上样于亲和层析柱，用平衡缓冲液充分洗去未结合蛋白后，分别用咪唑浓度为80和300 mmol/L的缓冲液（均含20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 7.5）洗脱亲和柱。收集洗脱峰，进行胰蛋白酶抑制活性的测定。收集活性峰，进行SDS-PAGE分析，用Superdex G-25脱盐柱将BTI的缓冲液置换为NaHCO3溶液（20 mmol/L，pH 8.0）后，进一步用真空冷冻干燥机冻干得到BTI干粉。

1.2.2 BTI-Sepharose亲和材料的制备

用碳酸钠缓冲液（250 mmol/L，pH 9.0）溶解BTI，并调整BTI浓度为5 mg/mL。用去离子水清洗CNBr活化琼脂糖凝胶表面的溶剂后，继续用碳酸钠缓冲液浸泡并洗涤。将凝胶与BTI溶液混合，在摇床上振荡，于25℃偶联6 h。然后加入Tris-HCl缓冲液（250 mmol/L，pH 8.3），继续反应6 h封闭剩余的活性基团。将偶联了BTI的凝胶填料装于柱中，分别用1 mol/L NaCl溶液和蒸馏水清洗10个柱床体积，置于4℃保存备用。

1.2.3 BTI-Sepharose柱对胰蛋白酶的亲和作用

用缓冲液（pH 7.2，20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl）平衡制备好的BTI-琼脂糖亲和层析柱。用相同的缓冲液配制胰蛋白酶溶液（浓度为30 mg/mL），过0.22 μm滤膜后，取1 mL上样于亲和层析柱，流速控制为1 mL/min，然后用HAc-NaAc缓冲液（pH 3.5，100 mmol/L）洗脱。检测280 nm处吸光度，收集蛋白峰，测定胰蛋白酶活性。

1.2.3.1 pH对BTI-Sepharose吸附胰蛋白酶的影响

用pH 7.2的20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl缓冲液平衡BTI-琼脂糖亲和层析柱，取100 μL胰蛋白酶（30 mg/mL），与250 μL牛血清白蛋白（5 mg/mL）溶液混合后，上样于层析柱，流速控制为1 mL/min，用pH 3.5的HAc-NaAc缓冲液（100 mmol/L）洗脱。收集穿透峰与洗脱峰，测定胰蛋白酶的活性，并进行SDS-PAGE鉴定。

改变缓冲液pH，用pH 5.0的20 mmol/L HAc-NaAc，50 mmol/L NaCl缓冲液平衡BTI-琼脂糖亲和层析柱，其它操作同上，研究不同pH对BTI-琼脂糖凝胶吸附胰蛋白酶的影响。

1.2.3.2 pH对BTI-Sepharose解吸附胰蛋白酶的影响

取100 μL 30 mg/mL胰蛋白酶，与250 μL 5 mg/mL牛血清白蛋白溶液混合后上样于亲和层析柱，平衡缓冲液为Tris-HCl 20 mmol/L，NaCl 50 mmol/L，pH 7.2，流速控制为1 mL/min。上样后，用pH 4.5的HAc-NaAc缓冲液（100 mmol/L）洗脱层析柱。分别收集穿透峰与pH 4.5缓冲液洗脱峰，测定各蛋白峰胰蛋白酶活性，并进行SDS-PAGE鉴定。

1.2.4 胰蛋白酶活性测定

胰蛋白酶活性测定按照文献[15-16]的方法进行，并稍加改动。以BApNA（Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐）为底物，在3.2 mL活性测定体系（100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含10 mmol/L CaCl2）中加入0.5 mL待测样品，37℃预热5 min后，加入17 μL底物BApNA（150 mmol/L，溶剂为二甲基亚砜），继续保温10 min后，加入0.5 mL 33%醋酸溶液终止反应，在410 nm的波长下测定反应体系中由产物对硝基苯胺（PNA）所产生的吸光度。空白体系加样顺序为先加入反应终止液33%醋酸，再加入相同体积的样品溶液。

1.2.5 胰蛋白酶抑制剂活性测定

按Sappasith等[17]的方法进行，并略作修改。在2.5 mL活性测定体系（100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含10 mmol/L CaCl2）中加入0.5 mL胰蛋白酶（20 mg/mL）和100 μL待测样品，37℃预热5 min后，加入17 μL底物BApNA（150 mmol/L，溶剂为DMSO），持续保温10 min后，加入0.5 mL 33%的醋酸溶液终止反应，测定410 nm处吸光度。对照组以100 μL待测样品的溶剂代替待测样品。按照公式（1）计算抑制率。

1.2.6 SDS-PAGE电泳

采用SDS-PAGE法鉴定蛋白纯度，以低分子质量蛋白质Marker（14.4～97.4 kDa）为对照，采用4%浓缩胶和15%浓缩胶，浓缩胶电压为80 V，分离胶电压为120 V。采用考马斯亮蓝R-250染色液，脱色液为50 mL甲醇、75 mL冰醋酸与875 mL重蒸水的混合液。

1.2.7 蛋白质浓度测定

采用福林酚法测定蛋白浓度，以牛血清白蛋白为标准品，按照福林酚蛋白浓度测定试剂盒说明书进行。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE鉴定BTI

BTI具有很好的耐热性，破碎菌体后在80℃下加热30 min，大量热不稳定的杂蛋白变性沉淀。离心后进行Ni2+-NTA亲和层析，结果见图1。通过对各蛋白峰抑制活性测定发现蛋白峰1和2无抑制活性，而蛋白峰3（含300 mmol/L咪唑的洗脱液）抑制胰蛋白酶活性很强，为目的蛋白。以低分子质量蛋白质Marker（14.4～97.4 kDa）为参照，将经Superdex G-25脱盐后的BTI进行SDS-PAGE鉴定，结果见图2。BTI（泳道1）在电泳图谱上显示单一条带，表明所得BTI纯度较高，达到电泳纯。同时也表明亲和层析是一种很高效的纯化方法，仅需一次层析便得到了高纯度的目的蛋白。

图1 BTI的亲和层析分离

图2 BTI的SDS-PAGE电泳图谱

2.2 BTI-琼脂糖凝胶对胰蛋白酶的吸附作用

BTI-琼脂糖凝胶与胰蛋白酶的结合见图3。如图3所示，在上样时出现了穿透峰1。当用pH 3.5的醋酸-醋酸缓冲液洗脱时，出现了蛋白峰2。以BApNA为底物鉴定胰蛋白酶活性，发现穿透峰1与洗脱峰2均能催化底物反应，产生明显黄色产物，具有胰蛋白酶活性。洗脱峰2的出现表明在pH 7.2的平衡缓冲液条件下上样时，胰蛋白酶结合到了BTI-琼脂糖凝胶上，抑制剂与胰蛋白酶的活性部位以非共价键相互作用形成类似酶-底物的米氏复合物[18]，在pH 3.5缓冲液条件下这种作用力减弱，胰蛋白酶从柱上洗脱下来。洗脱下来的胰蛋白酶在pH 3.5时催化活性不受影响。穿透峰1的出现可能是因为胰蛋白酶上样量过大，超过了亲和柱的吸附容量。

2.3 pH对BTI-Sepharose柱吸附胰蛋白酶的影响

降低胰蛋白酶上样量为3 mg，将胰蛋白酶与牛血清白蛋白混合样品上样于BTI亲和层析柱，在pH 7.2的平衡缓冲液条件下上样，pH 3.5的缓冲液洗脱，纯化层析结果见图4。上样与洗脱时均出现了蛋白峰，表明有一种蛋白在pH 7.2缓冲液的条件下未与亲和柱结合，另一种蛋白在此条件与亲和柱结合，但在pH 3.5缓冲液条件下与柱解离，被洗脱出来。对两个蛋白峰进行胰蛋白酶活性鉴定，发现穿透峰没有胰蛋白酶活性，而洗脱峰有活性，表明穿透峰为牛血清白蛋白，没有胰蛋白酶，胰蛋白酶全部结合到亲和柱上。SDS-PAGE结果（图5）显示洗脱样品胰蛋白酶为单一条带，穿透峰中只有牛血清白蛋白，进一步说明BTI-Sepharose柱可以特异结合胰蛋白酶。

图3 胰蛋白酶的亲和层析分离图谱

图4 胰蛋白酶与BSA在pH 7.2平衡条件下的层析图

图5 亲和层析蛋白峰的SDS-PAGE图谱

将胰蛋白酶（3 mg）与牛血清白蛋白混合样品在pH 5.0的平衡缓冲液条件下上样，收集穿透峰，经鉴定穿透峰有胰蛋白酶活性。SDS-PAGE结果（图6）显示穿透峰样品显示两条带，分别是牛血清白蛋白（BSA）和胰蛋白酶（Trypsin）。胰蛋白酶活性测定与SDS-PAGE结果均说明在pH 5.0的平衡缓冲液条件下，部分胰蛋白酶未能与BTI-Sepharose柱结合，吸附效果不好。由于BTI具有很好的pH稳定性，胰蛋白酶的最适作用条件为碱性环境，推测在pH 5.0时亲和柱吸附胰蛋白酶效率下降是由于胰蛋白酶空间构象发生了变化。图6 胰蛋白酶与BSA在pH 5.0平衡液下穿透峰的SDS-PAGE图谱

2.4 pH对BTI-Sepharose柱解吸附胰蛋白酶的影响

将胰蛋白酶与牛血清白蛋白混合样品在pH 7.2的平衡缓冲液条件下上样，用pH 4.5的醋酸缓冲液（0.2 mol/L）洗脱，纯化层析图谱见图7。经活性检测发现穿透峰样品没有胰蛋白酶活性，洗脱峰样品有一定活性（A410为0.075），但活性显著低于pH 3.5缓冲液的洗脱峰（A410为0.845）。SDS-PAGE（图8）结果显示穿透峰只有牛血清白蛋白条带，与活性测定结果一致。洗脱峰有一定胰蛋白酶活性，但SDS-PAGE结果并未出现酶的条带，表明洗脱峰中胰蛋白酶含量甚微，因此，洗脱效果不如pH 3.5的缓冲液。在pH 4.5条件下，胰蛋白酶与BTI-Sepharose柱仍有一定的亲和力，不能完全从柱上解吸，pH 4.5的缓冲液只能将一小部分与BTI结合不牢固的胰蛋白酶洗脱下来。

图7 在pH 4.5洗脱条件下胰蛋白酶与BSA的层析分离图谱

图8 在pH 4.5洗脱条件下样品的SDS-PAGE图谱

3 结果与讨论

通过原核表达、Ni2+亲和柱层析和Superdex G-25凝胶过滤层析技术分离纯化得到电泳纯的BTI，与CNBr-Sepharose载体偶联制备出亲和吸附剂BTI- Sepharose，可用于纯化胰蛋白酶。结果表明，所制备的BTI-Sepharose对胰蛋白酶具有良好的特异吸附性能，BTI-Sepharose与胰蛋白酶的吸附及解吸附作用受到缓冲液pH的影响。二者吸附的最适pH为7.2，缓冲液pH为3.5时能有效将柱上吸附的胰蛋白酶洗脱。试验制备的BTI-Sepharose亲和柱能够将胰蛋白酶与牛血清白蛋白的混合物分离且不降低原有酶的生物活性，实现了简单、快速、高效一步纯化胰蛋白酶的目的。

目前制备胰蛋白酶的方法常以动物胰脏为原材料，采用传统的盐析、沉淀结合超滤、分子筛层析、离子交换层析、疏水层析等技术。胰脏中大多数酶以酶原非活性的形式存在，经胰蛋白酶激活后形成具有活性的酶，然而动物胰脏中大部分的酶为丝氨酸蛋白酶家族，其中糜蛋白酶与胰蛋白酶的理化性质相近，难以将二者分离。传统方法纯化效率低、往往需要多种介质与多个步骤组合才能达到产品质量要求，难以形成产业化。亲和层析利用蛋白质等生物大分子间的相互作用力，与配体特异、可逆地结合在一起，从复杂的生物样品中分离得到目标产物，与其他方法相比较，特异性高，纯化效率高，适合含量少、杂质多的物质的分离纯化，具备产业化生产的条件[19]。目前虽然有牛和猪来源的胰蛋白酶已经商业化，然而胰蛋白酶在自然界很多物种中普遍存在，其性质不尽相同，可用于不同领域。如哺乳动物来源的胰蛋白酶最适作用温度多为50℃左右，在低温（如低于20℃）时活性较低，而某些深海生物来源的胰酶最适作用温度为20℃左右。在某些技术领域，如食品或药品加工制造领域，需要低温催化，可减少热能消耗、更多地保留热敏营养成分或减少副产物的生成等[20]。此次试验制备了胰蛋白酶亲和材料，有望分离得到更多未知胰蛋白酶类，开拓新型酶的研究与应用，具有巨大的科研意义和市场前景。