幽门螺杆菌毒力蛋白cagA基因敲除突变株构建及鉴定*

李抄，陈定宇，张晓怡，赵艳，王琴容，周建奖，谢渊

(贵州医科大学 地方病与少数民族性疾病教育部重点实验室，贵州省医学分子生物学重点实验室，贵州医科大学 分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004)

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤。据2018年全球流行病学资料显示，全球胃癌的发病率居恶性肿瘤的第6位，死亡率居第5位；在中国，胃癌的发病率和死亡率分别占全部肿瘤的第4位和第2位[1-2]。胃癌的发生发展涉及多个方面，主要包括宿主遗传学、环境因素和幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)感染[3]。Hp是一种螺旋状革兰阴性微需氧菌，它定殖在人类的胃黏膜上皮，是引起胃炎、消化性溃疡、胃癌的主要病因。Hp的发现加深了人类对慢性感染、炎症和癌症之间关系的认知，1994年世界卫生组织将Hp列为 I 类致癌因子[4-5]。全世界有近半数人感染Hp，但仅少数会发展成胃癌，究其原因，除宿主与环境因素外，HpcagA毒力表达是导致其感染后不同临床结局的可能原因[6]。细胞毒素相关基因A蛋白(cytotoxin associated gene A,cagA )是由HpcagA致病岛编码的一种120～145 kDa的蛋白质，通过IV型分泌系统(type Ⅳ secretion system，TFSS)注入胃上皮细胞，参与胃癌的发生发展，是目前所知的唯一被Hp注入胃上皮细胞并能模拟细胞内蛋白发挥作用的“癌蛋白”(oncoprotein)，但其致癌机制还不完全清楚[7-9]。基因打靶(gene targeting)是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术，是利用基因转移方法将外源DNA序列导入靶细胞后，通过外源DNA 序列与靶细胞内染色体上同源DNA序列间的重组，将外源DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，或对某一预先确定的靶位点进行定点突变，从而改变细胞遗传特性的方法[10-11]。目前基因打靶技术已应用在改造生物、培育新的生物品种，研究基因结构与功能、表达与调控，研究细胞生活周期调控机制，遗传病的基因治疗等多方面。为进一步明确cagA在Hp致胃癌发生发展中的作用，本实验运用基因打靶技术构建敲除cagA基因的Hp突变株，为后续研究cagA致病机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料、主要试剂及仪器

1.1.1材料 pACYC184质粒、pUCmT载体及细菌DNA提取试剂盒(上海生工生物公司)，幽门螺杆菌HP1004及胃癌原代细胞(贵州医科大学分子生物重点实验室保存)。

1.1.2主要试剂和仪器 双抗(美国 HyClone公司)，改良型RPMI-1640 培养基和胎牛血清(美国Gibco 公司)，氯霉素(chloramphenicol，Cm，中国 Beyotime公司)，哥伦比亚血琼脂培养基(英国Oxoid公司)，Taq DNA聚合酶和T4 DNA ligase(日本TAKARA公司)，anti-cagAantibody和anti-GAPDHantibody(美国CST公司)；电转化仪Electroporator 2510(中国 Eppendorf)，全制动化学发光成像分析仪(中国 上海天能科技公司)；Primer5.0设计引物合成于上海生工，见表1。

1.2 方法

1.2.1cagA基因的上、下游同源重组臂扩增 高保真PCR酶从Hp基因组上扩增cagA基因的上、下游同源重组臂，反应体系为50 μL[Hp基因组DNA 0.5 μL、10×pfu buffer 5 μL、dNTP(2.5×10-2mol/L) 0.5 μL、cagA-5F/3F及cagA-5R/3R (5×10-6mol/L)各0.5 μL，pfu DNA polymerase(5×10-3U/L) 0.5 μL，DMSO(5%) 2.5 μL，ddH2O补足体积]；聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)循环程序为95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，5个循环，72 ℃延伸7 min。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.2Cm的表达框序列扩增 从pACYC184质粒上扩增Cm的表达框序列，Cm抗性基因的扩增反应体系为50 μL：pACYC184质粒DNA 0.5 μL，10×pfu buffer 5 μL，dNTP(2.5×10-2mol/L) 0.5 μL，cagA-Cm-F和cagA-Cm-R (5×10-6mol/L)各0.5 μL，pfu DNA polymerase(5×10-6U/L) 0.5 μL，ddH2O 补足；PCR循环程序同方法1.2.1。

1.2.3融合PCR构建打靶片段cagA基因上、下游同源重组臂经设计与Cm抗性基因序列有部分重叠，可通过PCR直接融合，获得全长的打靶片段。反应总体系100 μL：上、下游同源重组臂PCR产物、Cm抗性基因PCR产物、5%DMSO各5 μL，10×pfu buffer 10 μL、dNTP(2.5×10-2mol/L)、cagA-5F、cagA-3R (5×10-6mol/L)及pfu DNA polymerase(5×10-6U/L)各1 μL，dH2O补足；PCR循环程序同方法1.2.1，循环数为25次。

1.2.4打靶载体(pUCmT-ΔcagA::Cm)的构建 在打靶片段PCR产物中直接加入Taq DNA聚合酶(5×10-6U/L)，于72 ℃反应30 min电泳并切胶纯化后与然后与50 mg/L pUCmT载体进行连接反应，反应体系10 μL：pUCmT(5×107ng/L) 2 μL，打靶片段(5×107ng/L) 6 μL，10×T4 buffer 1 μL，T4 DNA ligase(5×10-6U/L) 1 μL；16 ℃反应过夜。

1.2.5打靶载体的电转化 取4 mL液体培养(布氏肉汤加10%胎牛血清)的Hp分装于2 mL无菌Ep管中，4 ℃、6 000 r/min离心5 min收集菌体；等体积无菌去离子水轻柔吹打洗涤，4 ℃、6 000 r/min离心5 min收集菌体，相同方法重复洗涤1次；用100 μL无菌10%甘油轻柔悬浮菌体，取40 μL分装在预冷的0.5 mL无菌Ep管中即可用作电转化细胞。取500 ng预冷的打靶质粒加入40 μL新鲜制备的电转化细胞，4 ℃放置2 min，转移入2 mm Eppendorf电击转化杯，迅速放入电转化仪，2 500 V电压下电击转化；加入Hp培养液1 mL悬浮菌体，转入50 mL无菌尖底离心管，加入液体培养基5 mL，2.5 L厌氧罐内37 ℃、100 r/min震荡培养过夜。

1.2.6cagA基因敲除菌株Hp/ΔcagA::Cm的筛选 吸取500 μL打靶载体电转化后的细菌培养液转接5 mL液体培养液(含Cm 2×10-2μg/L)，于上述同样培养条件继续培养3～4 d，直至培养液浑浊；取微量浑浊培养液划线接种固体培养基(Karmali培养基，加10%脱纤维绵羊血和2×10-2μg/L Cm)，于微需氧厌氧罐内培养至单克隆形成。

1.2.7cagA基因敲除菌株Hp/ΔcagA::Cm的PCR鉴定 随机挑选若干阳性克隆，分别接种3 mL布氏肉汤(含10%胎牛血清)，厌氧罐条件下37 ℃、100 r/min培养至菌体明显浑浊，取少量菌液进行PCR扩增；用cagA外侧引物扩增时，如cagA基因未被替换，PCR产物长度为5 014 bp；而打靶载体替换成功时，产物长度则缩短为2 150 bp；反应体系50 μL：基因组DNA 0.5 μL，10×TaqPlus buffer 5 μL，dNTP(2.5×10-2mol/L) 0.5 μL，cagA-outF及cagA-outR(5×10-6mol/L)各0.5 μL，5% DMSO 2.5 μL，Taq Plus DNA polymerase(5×10-6U/L) 0.5 μL及ddH2O 补足；PCR循环程序同方法1.2.1，循环数为35次，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。

1.2.8原代胃癌细胞培养及Hp/ΔcagA::Cm、Hp/cagA感染原代胃癌细胞 按1.0×106/孔细胞数量接种于含DMEM完全培养基(10% FBS)6孔板中，37 ℃的 5%CO2孵育箱常规培养，感染前将6孔板中换成无双抗含Gibco血清培养基；Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA培养3 d，感染复数(mutiplicity of infection，MOI) 30 ∶1的比例分别感染原代胃癌细胞，24 h后倒置荧光显微镜下观察细胞形态，并分别收集各组细胞，血球计数板计数。

1.2.9Western blot检测原代胃癌细胞内cagA存在 按全蛋白提取试剂盒进行细胞全蛋白提取，按BCA蛋白含量检测试剂盒进行蛋白定量，10%PAGE分离蛋白，上样蛋白体积20 μL，电泳，湿转PVDF膜，5% 脱脂牛奶封闭，4 ℃孵育cagA一抗(1 ∶1 000/4 000)过夜，二抗(1 ∶10 000)室温孵育2 h，TBST清洗3次，按化学发光底物试剂盒进行反应，利用荧光凝胶成像系统曝光、显影及分析。

1.3 统计学分析

使用SPSS 17.0软件进行统计学分析，Graphpad Prism 7.0软件绘图，组间比较使用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 融合PCR构建打靶片段鉴定

cagA基因上、下游同源重组臂经设计与Cm抗性基因序列有部分重叠，可通过PCR直接融合，获得全长的打靶片段，长度为1 794 bp，见图1。

注：1为打靶片段，M为标准分子量参照(DNA Maker)。图1 打靶片段融合PCR结果Fig.1 Target fragment fusion PCR map

2.2 Hp/ΔcagA::Cm突变株PCR鉴定

PCR扩增鉴定结果显示，Hp/ΔcagA::Cm阳性克隆扩增产物为2 150 bp，野生型Hp/cagA菌株扩增产物为5 014 bp，表明成功获得Hp/ΔcagA::Cm敲出突变菌株，见图2。

注：1为野生Hp/cagA菌株，2为 Hp/ΔcagA::Cm突变株，M 为DNA分子量标准。图2 Hp/ΔcagA::Cm突变株PCR鉴定结果Fig.2 Hp/ΔcagA::Cm mutant PCR identification map

2.3 Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA感染的原代胃癌细胞形态

Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA分别感染3株胃癌原代细胞，24 h后荧光倒置显微镜下观察细胞形态改变，可见感染野生型Hp/cagA的原代胃癌细胞发生明显的细胞形态改变，由钝圆变为长梭形、纺锤形、不规则形，细胞死亡数量多，感染Hp/ΔcagA::Cm突变株的细胞形态改变较小，死亡细胞数量少，且差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，见图3。

注：A为Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA感染3株胃癌原代细胞，B为细胞数量的直条图；(1)与WZKHp/cagA,YHDHp/cagA组比较，P<0.01;(2)与HZMHp/cagA组比较，P<0.05。图3 Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA感染细胞形态改变 (100×)Fig.3 Hp/ΔcagA::Cm and Hp/cagA infected cell morphology changes (100×)

2.4 原代胃癌细胞内cagA蛋白表达

Western blot检测cagA蛋白(分子量135 kDa)表达情况，结果表明野生型Hp/cagA菌株及其感染3株原代细胞内cagA蛋白表达水平较Hp/ΔcagA::Cm突变型菌株及其感染3株原代细胞明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见图4。

注：A为Western blot检测cagA蛋白条带，B为cagA蛋白表达量的条图；(1)与HZMHp/ΔcagA::Cm组比较，P<0.01；(2)与WZKHp/ΔcagA::Cm组比较，P<0.01；(3)与YHDHp/ΔcagA::Cm组比较，P<0.01；(4)与Hp/ΔcagA::Cm组比较，P<0.01。图4 细菌及其感染细胞内cagA 表达情况Fig.4 CagA expression in bacteria and infected cells

3 讨论

全球约50%人口存在Hp感染，多数感染患者为无症状胃炎，少数发展为萎缩性胃炎甚至胃癌[12]。cagA是HP感染引起炎症反应的重要效应蛋白，被Hp注入胃上皮细胞的cagA发生磷酸化，磷酸化的cagA和Scr同源区2结合激活Scr同源区的磷酸化酶活性，从而引起瀑布式的级联反应；通过干扰细胞信息传导通路引起组织严重的炎症损伤，参与胃癌的形成过程[13]。cagA可引起胃癌细胞的增殖和凋亡紊乱[14]。临床检出的Hp包括cagA阳性和cagA阴性2种类型；cagA阳性Hp感染患者发生胃癌的风险高于cagA阴性者[15]。现有研究认为cagA与Hp引起疾病的严重程度相关；Hp/cagA+菌株可引起更严重的炎症反应，更容易引起胃萎缩和胃腺癌的发生，是Hp/cagA-菌株的2.0～28.4倍[16-17]；因此cagA在胃癌的发生发展过程中发挥重要作用。为了更好地研究Hp中cagA蛋白的致病功能，通过基因打靶的同源重组原理构建了HpΔcagA基因缺失突变株，为系统研究cagA基因功能创造了条件，也为进一步阐明Hp致病机制奠定基础。

基因打靶是分析基因功能的重要技术，用于定位功能基因，研究模式生物和一些重要微生物的全基因组功能，被广泛应用于生命科学与医学的研究领域[18]。基因打靶技术以同源重组为理论基础，同源重组机制在原核和真核生物中普遍存在，是保证物种遗传信息稳定性和多样性的一种重要机制[19]。有研究发现，新的遗传物质可以通过同源重组引人生物细胞的基因组，井对基因进行特异性修饰和改造[20-22]；也有研究报道，构建出了cagA全基因缺失的Hpylori突变株[23-24]，本研究利用高保真PCR酶从Hp基因组上扩增cagA基因的上、下游同源重组手臂；从pACYC184质粒上扩增Cm表达框序列。通过融合PCR技术获得cagA基因敲除用的打靶片段(上游同源手臂-氯霉素抗性基因-下游同源手臂)，将其克隆入通用载体pUCmT，获得打靶载体pUCmT-ΔcagA::Cm。然后通过电转化，将pUCmT-ΔcagA::Cm质粒直接转入Hp，在抗生素压力的帮助下，打靶片段和菌体基因组发生同源重组，通过氯霉素抗性筛选得到带有抗性标记的重组菌，随后因突变载体不能在Hp1004菌体内生长复制而丢失。

检测突变株Hp/ΔcagA::Cm是否还存cagA基因或蛋白，是最后认证cagA基因缺失突变株构建成功与否的关键。本研究对Hp/ΔcagA::Cm突变型菌株和野生型Hp/cagA菌株的基因组进行了PCR鉴定，用cagA外侧引物扩增时，野生株可以扩出完整的cagA基因和非编码序列的长约5 014 bp，而cagA缺失突变株cagA基因被打靶载体替换，产物长度则缩短为2 150 bp。另外本研究用Hp/ΔcagA::Cm突变型菌株和野生型Hp/cagA菌株感染原代胃癌细胞，Western blot实验均能从野生型Hp/cagA菌株及其感染细胞检出cagA蛋白，而Hp/ΔcagA::Cm突变型菌株及其感染细胞内均不能检出cagA蛋白，从而在蛋白水平上证实了上述实验结果，表明本次cagA缺失突变株Hp/ΔcagA::Cm构建成功。同时本研究还发现感染野生型Hp/cagA的原代胃癌细胞发生明显的细胞形态改变，由钝圆变为长梭形、纺锤形及不规则形，细胞死亡数量多，而感染Hp/ΔcagA::Cm突变株的细胞形态改变较小、死亡细胞数量少；这进一步证实cagA被Hp注入细胞后对细胞有一定的毒性作用。

综上所述，本实验成功构建了Hp/ΔcagA::Cm突变株，并在感染细胞中成功验证，且证实cagA蛋白对细胞有一定的毒性作用，为进一步研究Hp中cagA基因的功能，阐明其在Hp致病中的地位及作用奠定了实验基础。