诸氏鲻虾虎鱼封闭群遗传质量评价方法的建立

蔡磊，李建军，余露军，黄韧

(广东省实验动物监测所，广东省实验动物重点实验室，广州 510663)

诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobiuschulae)是我国本土一种小型海水鱼类，在繁殖生物学[1]、细胞生物学[2]、遗传学[3]以及毒理学[4]等领域的基础研究均表明，诸氏鲻虾虎鱼是一种比较优良的海水实验鱼类，如个体小、繁殖周期短、繁殖力强、便于实验室内饲养管理以及对污染物毒性敏感等。诸氏鲻虾虎鱼现已初步完成实验动物化研究，封闭群繁殖至第19代，近交系培育至第13代，且于全国30个省市推广应用，广泛用于石油开发污染物、船舶压载水、疏浚泥、重金属等污染物的生物毒性评价以及疾病模型研究等领域[5]。因海水鱼类特殊的生活环境，小型海水鱼标准化质控体系的建立仍是公认难题，尤其在遗传质量评价上，国内外的研究均相对薄弱。而在实验动物研究领域中，遗传背景清晰又是其最基本和最重要的条件要求，建立遗传质量评价技术是实现其标准化、规范化管理的重要手段。诸氏鲻虾虎鱼作为一种潜在的海洋模式鱼类，建立其遗传质量评价方法，对规范今后引种、保种、性状控制和饲养管理等具有重要实用价值，也有利于打造我国特色海洋模式鱼类品牌，促进我国海洋鱼类的资源优势转化为科研优势。

微卫星标记具有分布广、共显性、多态性丰富等优点，在遗传学研究上已经获得广泛应用[6-8]，国际实验动物学会(International Council for Laboratory Animal Science， ICLAS)[9]和Charles River等[10]均推荐微卫星标记作为实验动物遗传质量监测的工具。近年来利用微卫星标记对实验动物封闭群进行遗传质量检测已有较多报道，如大小鼠[11]、小型猪[12]、树鼩[13]、稀有鮈鲫(Gobiocyprisrarus)[14]等封闭群动物相继建立了基于微卫星标记技术的遗传质量评价方法。本研究利用微卫星标记分别对诸氏鲻虾虎鱼封闭群和野生群进行了遗传质量评价，以期建立诸氏鲻虾虎鱼封闭群遗传质量评价方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

诸氏鲻虾虎鱼样本分别为实验室繁殖的第14代封闭群，平均体重为(0.65 ± 0.16)g；和广东省深圳大鹏湾海域采集的野生群体，平均体重为(0.85 ± 0.36)g。其中，封闭群和野生群样本数量各为50尾(雌雄各半)。

1.2 方法

1.2.1 样本基因组DNA提取

参照北京天根动物基因组DNA抽提试剂盒说明书的方法提取样品基因组DNA并检测浓度和纯度，取出部分DNA样本将浓度调至50 ng/uL，保存于-20℃备用。

1.2.2 微卫星引物

参考文献[15]和Genebank数据库选取20个多态性较好的微卫星位点用于实验鱼遗传检测，所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物5’端用FAM或HEX荧光素标记，引物信息见表1。

1.2.3 PCR扩增及STR分型

PCR总反应体积为25 μL，其中含10 × PCR Buffer 2.5 μL(Mg2+Plus)，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，FAM和HEX标记的上下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，基因组DNA 50 ng，Taq酶(5 μmol/L)0.2 μL，双蒸水补齐至25 μL。PCR反应程序为94℃，预变性4 min；94℃变性30 s，退火40 s(退火温度因引物而异)，72℃延伸40 s，30个循环，最后于72℃下延伸10 min。

PCR产物用ABI 3730xl遗传分析仪(Applied Biosystems，美国)进行分型，原始峰图用GeneMapper 4.0基因分型软件(Applied Biosystems，美国)读取分型结果。

1.3 统计学分析

利用Popgene32(Version 1.31)软件统计分析微卫星基因座的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)和无偏期望杂合度(He)。根据Botstein等[16]的方法计算每个微卫星位点的多态信息含量(PIC)，计算公式如下：

式中，Pi、Pj分别为群体中第i和第j个等位基因频率，n为某一基因座上等位基因数。

2 结果

2.1 微卫星分型结果

统计各位点的STR分型结果，转换成基因型。20个微卫星标记均能获得清晰稳定的峰图。20个位点在100尾封闭群和野生群样本中共检测到201个等位基因，平均每个位点检测到10.05个等位基因，最多的为18个(位点171252)，最少的为3个(位点2347-2)。部分分型结果见图1。计算各微卫星位点在各群体中的多态信息含量(PIC)，封闭群除位点1135-1为中度多态外，其余位点均为高度多态；野生群除位点2347-2为中度多态外，其余位点均为高度多态。

2.2 遗传多样性检测

20个位点在封闭群和野生群中检测到平均等位基因数(Na)分别为7.40和9.05；平均观测杂合度(Ho)分别为0.5790和0.5710、平均无偏期望杂合度(He)分为0.6927和0.7162。诸氏鲻虾虎鱼封闭群和野生群遗传多样性均较为丰富，封闭群遗传多样性稍低于野生群。具体遗传参数见表2。

2.3 封闭群与野生群遗传结构分析

诸氏鲻虾虎鱼封闭群和野生群F统计量和基因流分析表明(表3)，仅Fis值中有2个位点为负值，Fit和Fst值均为正值，Fis正值范围为0.0069 ～ 0.6338，Fit和Fst值范围分别0.0194 ～ 0.6349和0.0032 ～ 0.1357，三者均值分别为0.1757，0.2142和0.0467。Fst和Fit均值显示群体内个体间的近交程度较低；Fst均值结果表明封闭群与野生群间遗传分化较小，封闭群保持较好的遗传杂合度。对群体基因流Nm值进行分析，Nm均值为5.0993(大于1)，表明基因结构相对稳定。诸氏鲻虾虎鱼野生群和封闭群遗传相似率和遗传距离分析结果显示，封闭群与野生群保持较高的遗传相似率(0.7835)和遗传距离(0.2439)。

表1 诸氏鲻虾虎鱼20个微卫星DNA位点信息Table 1 Information of 20 microsatellite DNA loci in Mugilogobius chulae

注：蓝色为样品；红色为Marker，从左到右分别为100, 120, 140, 160, 180 bp和200 bp。图1 位点2073-5在封闭群第5号样本的分型结果Note. Blue represents sample. Red represents marker, 100, 120, 140, 160, 180 bp and 200 bp from left to right, respectively.Figure 1 Typing results of locus 2073-5 in sample of closed colony No. 5

表2 诸氏鲻虾虎鱼封闭群和野生群在20个微卫星位点上的遗传参数
Table 2 Genetic parameters ofMugilogobiuschulaefrom closed colony and wild population at 20 microsatellite loci

位点Locus封闭群Closed colony野生群Wild populationNaHoHePICNaHoHePIC518-470.44000.64140.590390.70000.82420.79161135-170.34000.39290.3674100.64000.80610.77161513-1120.66000.85760.8342100.64000.68650.63921891-1110.60000.86360.8440110.50000.83230.80431997-540.62000.57840.480560.18000.59720.50982073-550.48000.59700.554170.56000.64890.59662152-4100.78000.85270.8255130.88000.83580.80792157-570.62000.55190.519570.64000.73350.68172317-160.56000.64790.585480.48000.58460.53382347-230.66000.63050.545750.54000.52710.44902368-440.60000.62440.552050.36000.60730.53302436-180.70000.78690.7471110.84000.78120.75132489-290.70000.79760.761770.58000.55230.51055980360.34000.76850.7261110.24000.83150.80138292680.48000.68120.623770.40000.66300.59358781950.50000.67330.607650.60000.60340.5392171252150.68000.86340.8425180.62000.90080.882218311190.42000.72440.695390.52000.61290.550836443960.64000.59960.5440100.68000.84040.811342126560.76000.72060.6704120.82000.85540.8303Mean7.40.57900.69270.64599.050.57100.71620.6694

2.4 样本量对封闭群遗传多样性参数的影响

利用Excel自嵌随机抽样方法，分别随机抽取封闭群中10尾、20尾、30尾、40尾样本，分别计算10、20、30、40和50尾样本条件下遗传参数(图2)，平均有效等位基因数(Ne)、Ho和He在10 ～ 50尾样本中变化不明显，Na在30尾样本后趋于稳定。

3 讨论

实验动物的一个重要特征是遗传背景清晰，我国现行实验动物遗传质量控制标准主要推荐生化标记方法[17]，由于生化位点携带的信息量不多，实验动物群体需要多态性更为丰富的标记来反应其遗传多样性[18]。微卫星标记作为基因组中广泛分布的一种短串联重复序列，其高度的多态性和共显性特征既可完成实验动物表型检测，还可对遗传杂合度进行评估。目前利用微卫星标记对实验动物遗传质量进行评价已有较多报道[19-20]。本研究利用20个微卫星标记对诸氏鲻虾虎鱼封闭群和野生群进行了遗传检测，根据Botstein等[16]提出的基因变异程度高低的多态信息含量指标：当PIC> 0.5时，该位点为高度多态性位点；当0.25 0.5)。一般情况下，多态性高的标记能提供更多的遗传信息，本研究所选用的标记可较好的反应实验鱼的遗传信息，可满足实验鱼遗传质量检测要求。

表3 诸氏鲻虾虎鱼20个微卫星位点的F统计量和基因流Table 3 F statistics and gene flow of 20 microsatellite loci in Mugilogobius chulae

封闭群动物与野生动物一个重要区别为封闭群在一定范围内保持相对稳定的遗传杂合度[21]，而野生群保持了较高杂合度。杂合度为群体遗传结构的重要指标，也是评价群体遗传变异的最直接和有效的方法。一般认为，当一个群体的平均有效杂合度小于0.5时，表明该群体遗传多样性偏低，有近交倾向，当平均有效杂合度高于0.7时，遗传杂合度偏高，群体间个体差异较大，群体的平均有效杂合度在0.5 ～ 0.7之间时才为合格的封闭群动物。目前在基于微卫星标记技术的实验动物封闭群遗传质量检测中，多采用遗传杂合度是否在0.5 ～ 0.7范围之间作为判定指标[19-20]，如王洪等[11]推荐将平均杂合度在0.5 ～ 0.7之间作为合格封闭群大小鼠的评价指标；李薇等[22]利用微卫星标记对5个长爪沙鼠封闭群遗传检测发现，平均有效杂合度0.5 ～ 0.7区间范围可作为长爪沙鼠封闭群遗传合格与否的量化指标；孙瑞萍等[12]利用微卫星标记对封闭群五指山猪遗传质量进行分析，发现封闭群遗传杂合度为0.69，符合封闭群动物特征，可用于五指山小型猪遗传多样性评估。

由于国内外在鱼类封闭群培育上起步较晚，目前关于实验鱼封闭群微卫星遗传质量检测的报道相对较少，国内仅见顾党恩等[14]和李慧慧等[23]分别利用微卫星标记对稀有鮈鲫连续代系封闭群(P0，F1 ～ F8)的遗传质量进行评价，发现遗传杂合度均在0.5 ～ 0.7之间。本研究中诸氏鲻虾虎封闭群和野生群平均无偏期望杂合度分别为0.6927和0.7162，封闭群平均无偏期望杂合度在0.5 ～ 0.7范围之间，而野生群平均期望杂合度在0.7以上。如无发生近交，鱼类野生群体遗传杂合度通常高于0.7，如鳙(Aristichthysnobilis)为0.882[24]、黄鳍棘鲷(Acanthopagruslatus)为0.741[25]、拟鲤(Rutilusrutilus)为0.9168[26]、鳜(Sinipercachuatsi)为0.71[27]等。可见平均无偏期望遗传杂合度值在0.5 ～ 0.7区间范围可作为一种判定诸氏鲻虾虎鱼封闭群遗传质量是否合格的候选指标，同时也发现封闭群与野生群平均遗传杂合度差异较小，封闭群仍保持较高的杂合度，推测可能与以下因素有关：①该封闭群原始建群的P0代亲本来自此野生群采样地区，二者存在相似的遗传基础；②该封闭群始终保持较大的群体规模(大于6000尾)，且自建群起严格按照实验动物要求繁殖和管理，有效保持了群体遗传杂合度。同时对诸氏鲻虾虎鱼封闭群和野生群体进行遗传结构分析发现，封闭群与野生群间遗传分化较小，说明诸氏鲻虾虎鱼封闭群在遗传背景上与此野生群存在关联性，也侧面证明该封闭群在培育过程中未发生近交。

本研究同时发现，当群体数量达到30尾以上，平均等位基因数趋于稳定，与稀有鮈鲫封闭群的研究结果类似[23]，而对于平均有效等位基因数、平均观测杂合度和平均期望杂合度等指标，各个抽样数量间差异不明显，可能与本研究选用标记多态性较高有关(仅有1个标记为中度多态，其余均为高度多态)。