海洋细菌Vibrio fluvialis的分离鉴定、产琼胶酶条件优化及酶的分离纯化

李驰，李春生，杨贤庆*，戚 勃，赵永强，王悦齐

1(中国海洋大学 食品科学与工程学院，山东 青岛,266000) 2(中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部水产品加工重点实验室，广东 广州,510300)

琼胶又称琼脂，在食品中作为胶凝剂、增稠剂和稳定剂被广泛应用[1]。琼胶主要存在于龙须菜、石花菜、江蓠等红藻体内，由琼脂糖和硫琼胶组成[2]。琼脂糖是由(l→3)-O-β-D-半乳糖和(1→4)-O-3, 6内醚-α-L-半乳糖交替组成的琼二糖重复单位连接而成，而硫琼胶的结构较为复杂，由硫基丙酮酸、D-半乳糖、半乳糖醛酸等组成[3]。

琼胶寡糖主要由琼胶水解产生，研究表明其具有良好的抗氧化、抗病毒等活性，在食品与医药领域有着广泛的应用前景[4]。目前在工业上琼胶寡糖一般使用酸解法生产，但是该方法存在产物均一性差、产物回收难、反应条件不易控制等问题，严重制约了对其开发和利用。琼胶酶是一类能够降解琼胶的酶，根据其作用方式不同可以分为α-琼胶酶和β-琼胶酶2类。α-琼胶酶能够裂解琼脂糖的α-1,3糖苷键，生成以3,6-内醚-半乳糖为还原性末端的琼寡糖，而β-琼胶酶能够裂解琼脂糖的β-1,4糖苷键，生成以β-D-半乳糖为还原性末端的新琼寡糖[5]。目前发现的琼胶酶大部分为β-琼胶酶。与酸解法相比，酶解法具有寡糖得率高、产物均一性好等优点。除了可用于制备琼胶寡糖，琼胶酶还可以用于琼脂糖凝胶电泳后DNA的回收[6]、海藻多糖结构分析[7]、红藻原生质体制备[8]等方面。因此，琼胶酶具有十分重要的研究价值。

琼胶酶主要存在于以琼胶为碳源的微生物体内，这些微生物大多来源于富含琼胶的海藻表面和以海藻为食的海洋软体动物消化道内。现阶段，绝大多数被分离研究的琼胶酶都是来自海洋微生物，主要包括弧菌属(Vibriosp.)[9]、噬琼胶菌属(Agarivoranssp.)[10]、芽孢杆菌属(Bacillussp.)[11]、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonassp.)[12]、不动杆菌属(Acinetobactersp.)[13]和海水杆菌属(Aquimarinasp.)[14]等。目前已有不少产琼胶酶菌株被分离出来，但由于酶活力低、产酶性状不稳定等因素限制，导致琼胶酶难以工业化生产。

本研究从龙须菜表面分离得到了1株具有高琼胶酶活力的菌株A8，采用VITEK 2 GN微生物鉴定系统和16S rRNA基因序列分析对其进行鉴定；利用培养基成分和培养条件优化，确定了该菌株的最佳产酶条件；通过(NH4)2SO4沉淀、离子交换层析等技术对菌株分泌的琼胶酶进行纯化，并利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝胶电泳确定琼胶酶的分子质量。为琼胶酶生产菌株的筛选和应用提供重要技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

菌株A8分离自腐烂的龙须菜表面。

1.1.2 培养基

(1)平板和斜面保藏培养基(g): 琼脂20，NaCl 10，胰蛋白胨10，酵母浸粉5，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.5。

(2)液体种子培养基(g): NaCl 10，胰蛋白胨10，酵母浸粉5，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.5。

(3)发酵培养基(g): 琼脂2，酵母浸粉4，人工海水1 000 mL[15]，pH 7.0。

以上培养基均经过121 ℃，15 min高压蒸汽灭菌; 发酵培养基(50 mL)分装至250 mL锥形瓶内。

1.1.3 主要试剂

琼脂粉和酵母浸粉，广东环凯微生物科技有限公司；DEAE Sepharse FF，合肥博美生物科技有限公司。DNS试剂配制参考文献[16]。

1.2 主要仪器与设备

全自动细菌鉴定仪，法国Bio Mérieux公司；SQ510C立式压力蒸汽灭菌锅，日本YAMATO；台式高速冷冻离心机，德国Sigma公司；低温恒温培养箱，日本三洋公司。

1.3 实验方法

1.3.1 产琼胶酶菌株的分离纯化

称取5 g腐烂龙须菜到50 mL无菌水中，摇匀。将稀释10-1～10-6六个浓度梯度的菌悬液分别涂布在LB平板培养基中，37 ℃培养2 d，选取凹陷较大的菌落接种到新的平板中，37 ℃培养2 d后用鲁戈氏碘液染色，挑取透明圈最大的菌落，多次划线，最终筛选出具有高琼胶酶活力的菌株A8，保存于斜面培养基中。

1.3.2 菌株A8的生理生化鉴定

将斜面保藏的菌株划线接种到新鲜斜面培养基上，37 ℃培养20 h收集菌体，用4.5 g/L的NaCl溶液稀释至比浊度为0.5～0.63 MCF，将配制好的菌液和革兰氏阴性菌鉴定卡放入全自动细菌鉴定仪，用VITEK2 GN微生物鉴定系统对菌株进行鉴定。

1.3.3 16S rRNA基因序列分析

菌株A8的16S rRNA基因测序由北京六合华大基因科技有限公司完成。将测得的16S rRNA基因序列在NCBI上进行比对分析。选择同一属内序列相似标准菌株的16S rRNA基因序列，使用Clustal W进行多序列对比。使用MEGA 5.1进行系统发生分析，采用最大似然法构建系统进化树[17]。

1.3.4 发酵条件优化

除特别说明外，培养温度为37 ℃，转速为180 r/min，培养时间为24 h，接种量为2%(体积分数，下同)，250 mL锥形瓶装液量为50 mL，测定发酵液中琼胶酶的活力，以确定最佳的发酵条件，每次优化的结果都用于之后的实验。

1.3.4.1 碳源

分别以2 g/L琼胶、2 g/L葡萄糖、2 g/L蔗糖、2 g/L半乳糖、2 g/L琼胶+2 g/L葡萄糖、2 g/L 琼胶+2 g/L 蔗糖、2 g/L琼胶+2 g/L半乳糖作为培养基的唯一碳源，其他成分同发酵培养基，以确定最佳的碳源种类。然后改变培养基中最佳碳源的质量浓度(0、1、2、3、4、5 g/L)，以确定最佳碳源的质量浓度。

1.3.4.2 氮源

分别以2 g/L蛋白胨、2 g/L酵母浸粉、2 g/L(NH4)2SO4、2 g/L NH4NO3、2 g/L NH4Cl、2 g/L酵母浸粉+2 g/L NH4Cl作为培养基的唯一氮源，以确定最佳的氮源种类。然后改变培养基中最佳氮源的质量浓度(1、2、3、4、5 g/L)，以确定最佳的氮源质量浓度。

1.3.4.3 NaCl质量浓度

在培养基中添加不同质量浓度的NaCl(0、5、10、15、20、25 g/L)，以确定培养基中最佳的NaCl质量浓度。

1.3.4.4 接种量

以最适产酶培养基为基础，将菌液分别按照体积分数为1%、2%、3%、4%、5%、6%的接种量进行接种，以确定菌株A8最佳的接种量。

1.3.4.5 初始pH

分别调节产酶培养基的初始pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，以确定菌株的最适初始pH。

1.3.4.6 培养温度

设置不同培养温度(15、20、25、30、37、40 ℃)进行培养，以确定菌株的最适培养温度。

1.3.4.7 正交实验

在单因素试验结果的基础上，选择3个影响最大的因素进行正交试验。在180 r/min转速下培养24 h，然后测定发酵液中琼胶酶的活力，以获得菌株A8发酵产酶的最佳条件。

1.3.5 菌株生长对其产酶影响

将菌株接种于种子培养基中，在最适条件下培养24 h，以最适接种量接种于优化后的发酵培养基中，每隔一段时间取一次样，于600 nm处测其吸光度，并测发酵培养基上清液的酶活力，利用Pearson相关性分析研究菌株生长对其产琼胶酶的影响。

1.3.6 酶的分离纯化

1.3.6.1 (NH4)2SO4沉淀

菌株A8的发酵液在8 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，分别在上清液中加入(NH4)2SO4至0%～80%饱和度，4 ℃静置2 h，10 000 r/min、4 ℃条件下离心20 min，用pH 7.0磷酸缓冲液溶解沉淀后放入透析袋内透析除去(NH4)2SO4，然后测定不同饱和度透析液的琼胶酶活力和蛋白含量，以确定(NH4)2SO4沉淀的最佳饱和度范围，然后采用(NH4)2SO4分级沉淀方法对琼胶酶进行粗分离。

1.3.6.2 DEAE阴离子交换层析

将透析所得粗酶液用PEG-20000浓缩，然后经0.22 μm微孔滤膜过滤后上样于DEAE阴离子交换柱，用0.3 mol/L的NaCl溶液洗脱，流速控制为1.5 mL/min，得到纯化后的酶液。

1.3.6.3 SDS-PAGE凝胶电泳[7]

SDS-PAGE凝胶电泳由12%的分离胶和8%的浓缩胶组成，蛋白质的染色与脱色均采用常规考马斯亮蓝染色法和脱色技术。

1.3.7 琼胶酶活力测定

将2 mL 2 g/L的琼胶溶液加入25 mL比色管中，40 ℃预热10 min，加入0.1 mL酶液，混匀后于40 ℃反应30 min，用沸水浴灭活5 min的酶液加底物作为空白对照，加入2 mL DNS试剂，于沸水浴中反应5 min，冷却后定容至25 mL，测520 nm处的吸光值。以每分钟产生1 μg还原糖的酶量定义为1个酶活力单位(U)。

1.3.8 统计分析

每个实验都设置3组重复，使用SPSS 20软件对实验数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，使用多重比较Tukey对每个实验组数据之间的差异性进行检验，每个图中数据之间无相同的字母即为差异显著，P<0.05。

2 结果与分析

2.1 产酶菌株的鉴定

革兰氏染色结果显示，A8为革兰氏阴性菌。采用VITEK 2 GN微生物鉴定系统分析结果如表1所示，菌株A8与V.fluvialis的可能性百分率为90%，因此初步确定菌株A8属于弧菌属(Vibrio)。进一步，将菌株A8的16S rRNA基因序列在NCBI比对后发现，其与多种弧菌属的菌株相似度较高。选择与菌株A8序列相近的弧菌属标准菌株的16S rRNA基因序列，构建系统进化树。经计算，菌株A8的16S rRNA基因序列与V.fluvialisNBRC103150的距离最近，二者同源性为99.38%。综合生理生化和分子生物学鉴定结果，最终确定该菌为Vibriofluvialis。因此，将产琼胶酶海洋菌株A8重新命名为VibriofluvialisA8。本研究也是首次报道Vibriofluvialis具有琼胶酶活力。

表1 采用VITEK 2 GN微生物鉴定系统分析菌株A8的生理生化特征

图1 利用最大似然法构建菌株A8的系统进化树

2.2 发酵条件优化

2.2.1 碳源的优化

不同种类碳源对菌株琼胶酶活力的影响见图2-A。由图2-A可知，当培养基中单独添加琼胶、葡萄糖、半乳糖或蔗糖时，菌株A8所产琼胶酶的活力会存在显著差异，当琼胶作为培养基的唯一碳源时，琼胶酶的活力最高，为5.60 U/mL。在以琼胶作为唯一碳源的培养基中分别加入葡萄糖和蔗糖时，琼胶酶的活力比琼胶单独作碳源时降低，可能是因为当葡萄糖或蔗糖与琼胶同时存在时会降低菌株对琼胶的利用，从而抑制了琼胶酶的分泌。当半乳糖与琼胶同时存在时，琼胶酶的活力比琼胶作为唯一碳源时高，达到7.91 U/mL，这可能是添加半乳糖会有利于菌株A8的生长，因此选择琼胶和半乳糖作为培养基的碳源。本研究进一步优化了培养基中琼胶和半乳糖的最佳质量浓度。首先研究当琼胶作为唯一碳源时不同的碳源质量浓度对琼胶酶活力的影响(图2-B)。当琼胶的质量浓度低于2 g/L时，琼胶酶活力随着琼胶质量浓度的增加而提高，当琼胶的质量浓度为2 g/L时酶的活力最高，这与吴国汉[18]的研究结果一致。当琼胶的质量浓度继续增加时，琼胶酶活力反而下降，可能是因为琼胶的质量浓度过高会限制培养基的流动性，使营养物质分布不均匀，同时影响通气量，从而抑制菌株分泌琼胶酶[19]。然后研究了在琼胶质量浓度为2 g/L时不同质量浓度的半乳糖对琼胶酶活力的影响(图2-C)。半乳糖质量浓度为3 g/L时，菌株所产琼胶酶的活力最高，达到8.10 U/mL，因此选择2 g/L的琼胶和2 g/L的半乳糖作为培养基的最适碳源质量浓度。

A-碳源种类；B-琼胶质量浓度；C-半乳糖质量浓度；D-氮源种类；E-酵母浸粉质量浓度；F-NaCl质量浓度

2.2.2 氮源的优化

由图2-D可知，菌株A8在生长繁殖过程中可以利用有机氮源或无机氮源，不同种类的氮源对琼胶酶活力的影响差异显著。当酵母浸粉作为培养基中唯一的氮源时琼胶酶的活力最高。因此，选择酵母浸粉作为菌株A8发酵产酶的最适氮源。进一步优化了培养基中酵母浸粉的最佳质量浓度。如图2-E所示，琼胶酶活力随着酵母浸粉质量浓度的增加先上升后下降，在质量浓度为3 g/L时最大，达到8.88 U/mL。这与产琼胶酶海洋菌株Agarivoranssp.FG15的最适氮源质量浓度一致[20]。因此，选择3 g/L酵母浸粉作为菌株A8产酶培养基的氮源。

2.2.3 NaCl质量浓度的优化

海洋菌株的生长状况与培养基的渗透压有一定关系，而培养基渗透压的大小主要取决于NaCl的质量浓度[21]。因此，可以通过调节培养基中NaCl的质量浓度从而使菌株处于最适的生长状态。在人工海水的基础上优化NaCl的质量浓度来确定用于菌株A8产酶培养基的最适渗透压。图2-F表明，当培养基中NaCl的质量浓度为5 g/L时培养基上清液中琼胶酶的活力最高，为11.00 U/mL。当NaCl质量浓度>5 g/L时，琼胶酶活力随着NaCl质量浓度的增加而降低，这可能是因为过高的渗透压抑制了细菌生长，从而影响菌株A8的产酶。因此，菌株A8产酶培养基的最适NaCl质量浓度为5 g/L。

2.2.4 接种量的优化

接种量对琼胶酶活力的影响如图3-A所示。接种量的改变对培养基中琼胶酶的活力无显著性影响，当接种量为2%时，琼胶酶的活力最高，为10.80 U/mL。邵嫄等[22]同样研究发现，当接种量为2%时，海洋菌株Vibriosp.NTi所产琼胶酶的活力最高。因此，选择2%作为菌株A8的最适接种量。

A-接种量；B-pH；C-温度

2.2.5 培养基pH的优化

培养基pH对琼胶酶活力影响很大，一方面会影响菌株生长，另一方面可能会使酶的活性位点在形成离子状态时产生不可逆的钝化或失活[23]。由图3-B可知，pH为6.0时琼胶酶活力最高，为12.35 U/mL。何宇等[24]研究发现,海洋菌株D3的最适初始pH为6.5，与菌株A8相似。本研究发现，pH低于6.0或高于7.0时，琼胶酶活力均表现出明显下降趋势，可能是由于酸性和碱性环境抑制菌株产酶及琼胶酶活力。

2.2.6 培养温度的优化

温度对琼胶酶活力的影响如图3-C所示，当培养基温度在15～25 ℃之间时，琼胶酶活力随着温度的升高而增加，琼胶酶活力在25 ℃时最高。研究发现，产琼胶酶海洋菌株Pseudoalteromonassp.CY24[25]、AgarivoransalbusYKW-34[26]的最适培养温度与本实验一致为25 ℃。高于25 ℃时，琼胶酶活力随着温度增加而降低，可能是因为温度过高抑制菌株的生长繁殖。因此，菌株A8的最适培养温度为25 ℃。

2.2.7 正交试验结果

单因素试验结果表明琼胶质量浓度、培养基初始pH、培养温度3个因素对菌株A8产酶影响最大，选择这3个因素做3因素3水平正交试验，正交试验设计如表2所示。产琼胶酶培养基成分的正交试验结果如表3所示。3个因素对菌株产酶的影响程度为A>B>C，即琼胶质量浓度对菌株产酶的影响最大，其次是培养基初始pH，最后是培养温度。最佳组合为A2B3C1，也就是琼胶质量浓度为2 g/L、初始pH为7.0、培养温度为20 ℃，在此条件下培养24 h后发酵液中琼胶酶的活力达到21.80 U/mL。与已报道的琼胶酶产生菌的酶活力[27-28]相比具有一定的优势。

表2 产琼胶酶培养基成分的正交试验因素和水平表

表3 产琼胶酶培养基成分的正交试验结果

2.3 菌株生长对其产酶影响

最终确定菌株A8的最适产酶培养基为在人工海水中添加琼脂2 g/L、半乳糖3 g/L、酵母浸粉3 g/L、NaCl 5 g/L；最适培养条件为温度20℃、接种量2%、pH 7.0。进一步研究菌株A8生长与产酶之间的相关性。在最适培养条件下，菌株在最适产酶培养基中的生长与产酶曲线如图4所示。

图4 菌株A8的生长曲线及产酶曲线以及其Pearson相关性

菌株A8在6 h之后进入对数生长期，6～21 h内生物量迅速的增长，在21～30 h达到稳定期，并且发酵液中琼胶酶的活力在24 h时达到最大值，之后菌株进入衰亡期，发酵液中琼胶酶的活力逐渐下降。Pearson相关性分析显示，菌株A8的生长与产酶具有显著相关性(P<0.01)，表明生长状况对菌株产酶具有重要影响。

2.4 琼胶酶的分离纯化

不同(NH4)2SO4饱和度下沉淀物中的蛋白含量与琼胶酶总活力如图5-A所示。结果显示，随着(NH4)2SO4饱和度的增加，沉淀物的蛋白含量与琼胶酶总活力逐渐增加，当(NH4)2SO4饱和度为30%～80%时琼胶酶的总活力较高。然而，当硫酸铵饱和度为70%～80%时，蛋白含量上升速度明显超过琼胶酶总活力的上升速度，推测此时析出的蛋白质大多为杂蛋白。因此在后续纯化步骤中，采用饱和为30%～60%的(NH4)2SO4分级沉淀方法进行琼胶酶的粗分离。进一步，采用DEAE阴离子交换层析对初分离的琼胶酶进行纯化。琼胶酶的DEAE阴离子交换层析纯化结果如图5-B所示，使用0.3 mol/L NaCl溶液洗脱后得到了2个峰，分别对2个峰的琼胶酶活力进行测定，结果显示只有第2个峰具有琼胶酶活力。

A-不同(NH4)2SO4饱和度下沉淀物中的蛋白含量于琼胶酶活力关系；B-琼胶酶的DEAE阴离子交换层析纯化结果;C-琼胶酶SDS-PAGE凝胶电泳结果泳道1-Marker;泳道2-(NH4)2SO4沉淀得到的酶液;泳道3-发酵液上清液;泳道4-离子交换层析得到的酶液

分别对菌株A8发酵培养基上清液、(NH4)2SO4沉淀、DEAE阴离子交换层析的总蛋白和总酶活力进行测定，然后计算出比活力、回收率及纯化倍数，结果如表4所示。经(NH4)2SO4沉淀和DEAE阴离子交换层析纯化后，琼胶酶的比活力为141.52 U/mg，回收率为15.21%，纯化倍数为3.26。进一步对纯化后的琼胶酶进行SDS-PAGE凝胶电泳验证，结果如图5-C所示。最初的发酵液上清中蛋白条带较多，经过(NH4)2SO4沉淀和离子交换层析后得到单一条带，分子质量约为37 kDa，推测为琼胶酶。研究发现，不同种类微生物所产琼胶酶的分子质量有一定的差别：从南极分离出的Pseudoalteromonassp.NJ21所产琼胶酶分子质量为80 kDa[29]；自海洋沉积物中分离出的Acinetobactersp.PS12B所产琼胶酶分子质量为24 kDa[13]。后续将进一步对分离的琼胶酶的酶学性质和结构组成进行深入研究。

表4 琼胶酶分离纯化结果

3 结论

本实验从龙须菜表面分离出1株产琼胶酶的海洋细菌，初步鉴定为革兰氏阴性菌。利用VITEK 2 GN生理生化鉴定和16S rRNA基因序列的系统进化树分析，鉴定该菌为V.fluvialis，重新命名为VibriofluvialisA8。通过单因素试验和正交试验确定其最适产酶培养基为在人工海水中添加2 g/L琼脂、3 g/L半乳糖、3 g/L酵母浸粉、5 g/L NaCl；最适培养条件为温度20 ℃、接种量2%、pH 7.0。在上述条件下培养24 h，发酵液中的琼胶酶活力达到21.80 U/mL，是优化之前的4.05倍。采用(NH4)2SO4分级沉淀和DEAE阴离子交换层析，得到了电泳纯度较高的琼胶酶，纯化倍数为3.26，比活力为141.52 U/mg，回收率为15.21%。纯化后的琼胶酶经SDS-PAGE凝胶电泳检测为单一条带，分子质量为37 kDa。该菌株分泌的琼胶酶经纯化后有较高酶活力，可用于琼胶寡糖的制备。