心肌铁过载兔模型的制作及铁沉积规律的研究

齐国将，钟德琳，蓝海梅，郭敏，郭亚楠，彭鹏

(广西医科大学第一附属医院放射科，南宁 530021)

铁离子是机体必不可少的微量元素之一，在机体参与氧气运输、血红蛋白合成、DNA合成、线粒体能量代谢以及呼吸链复合体的组成等中起着关键的作用[1]。正常机体内铁代谢水平处于稳定状态，当体内出现铁的异常蓄积时，机体多个系统出现对应的代谢障碍，影响人体健康。铁过载是由于机体内铁供需关系失衡，铁在某些组织脏器蓄积的病理过程。持续性输血、长期摄入铁剂过多、铁代谢相关基因突变等原因是导致铁过载的原因[2-3]。研究表明，铁过载除了发生在血液系统疾病，如地中海贫血、骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血等因疾病本身原因导致的铁过载[4]，还和神经系统、内分泌系统、心血管系统等多个系统的疾病，如共济失调、2型糖尿病、阿尔兹海默病、病毒性肝炎、心力衰竭等紧密相关[5-9]。铁过载导致的心肌功能的损害越来越得到研究学者的关注[10-11]，但是由于临床病人机体差异性大，活检取材不便，重复性差，无法有效的得到铁过载与心肌功能损害的关系。目前心肌铁过载动物模型制作方法关于实验动物的选择并没有一个统一的标准，比如：小鼠、大鼠、白兔等。在一些需要手术干预或者影像成像方面的研究，体型大的动物较小的易于操作。黄璐等的研究有提到家兔心肌铁过载模型的制备，但是侧重点在于心功能磁共振的评价，对于心肌铁过载规律并没有进行详细分析[12]。本研究就心肌铁超负荷家兔的制作方法及心肌铁沉积规律进行探讨，为铁过载动物模型制作及心肌铁沉积规律的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

普通级新西兰白兔40只，3月龄，均为雄性，体重2.0 ～ 3.0 kg，由广西医科大学动物实验中心提供【SCXK(桂)2014-0002】，饲养于广西医科大学实验动物中心【SYXK(桂) 2014-0003】，室内温度21 ～ 24℃，湿度50% ～ 70%，光源：明12 h/暗12 h 交替。随机选取32只为实验组，8只为正常对照组。普通兔营养饲料喂养，饮用自来水。所有新西兰白兔操作均符合广西医科大学实验动物福利与伦理委员会(伦理批准号:201807001)

1.1.2 仪器与试剂

右旋糖酐铁(铁浓度:150 mg/mL)购自广西化工研究院兽药厂；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9140 A型，上海柏欣仪器设备厂，中国)；火焰原子吸收分光光度计(ZA3000，日立公司，日本)。

1.2 方法

实验组32只白兔每周一称重后颈背部皮下注射右旋糖酐铁，注射剂量为200 mg/kg。注射铁剂7天(周日)随机选取2只处死；每间隔1周随机处死对照组1只。处死方法为经兔耳缘静脉注射过量的3%戊巴比妥钠溶液致兔安乐死。处死前经耳缘静脉抽取静脉血2 mL，送广西医科大学第一附属医院检验科进行血清铁(serum iron，SI)测定。兔处死后解剖取出心脏、肝。剔除心脏大血管及心包后，选取心室中部区域，用手术刀垂直心脏长轴横断切下约5 mm厚组织(保留完整的双心室及室间隔结构)送检病理。余心脏组织用生理盐水反复冲洗，洗净血液后置入电热恒温鼓风干燥箱(温度65℃)烘干至重量不再变化(约需48 h)。烘干心脏组织送广西壮族自治区分析测试研究中心经粉碎、硝酸硝化处理后，用火焰原子吸收分光光度计测定心脏铁浓度(cardiac iron concentration，CIC)。肝剔除大的血管、胆管等后，随机选取小拇指大小组织送检病理，余处理方式与心脏相同。送检心、肝组织经10%甲醛溶液固定24 h后，蜡埋、切片，行HE染色及普鲁士蓝染色。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 病理

2.1.1 大体病理

随着右旋糖酐铁剂量逐渐增加，肉眼观实验组白兔心脏大小、形态、硬度及表面颜色与正常对照组相比相差不明显。实验组白兔肝、脾与对照组相比，大小、形态及硬度无明显变化，脏器颜色随注射铁剂时间的增加而逐渐变暗黑(图1)。

注：A：正常白兔；B：注射铁剂后第16周的白兔。图1 白兔体内脏器的大体病理(从左至右依次为脾、肝、心脏)Note. A, Normal rabbit. B, Rabbit of the 16th week after injection of iron.Figure 1 Gross pathology of internal organs in rabbits (spleen, liver, heart from left to right)

2.1.2 镜下病理

实验组白兔心肌、肝铁经普鲁士蓝染色，通过显微镜下观察肝及心肌室间隔位置铁含量。第1周心肌内未见铁颗粒沉积(0级)；肝内见弥漫分布铁颗粒，不仅肝窦内有铁沉积，部分肝细胞内也可见铁颗粒(0级)。第2周开始，心肌内可见散在细小的铁颗粒，分布范围< 50%(I级；图2A)，第5 ～ 16周，心肌内见较弥漫铁颗粒沉积，分布范围50% ～ 75%(II级；图2B)。实验过程中未见Ⅲ级铁沉积。随着注射铁剂剂量的增加，心肌内铁沉积颗粒逐渐增多，铁颗粒多沉积于细胞间质，少量进入细胞内。第2周开始几乎所有肝窦及肝细胞内见大量铁颗粒，受累阳性细胞约100%(III级；图2C)。最终得到心肌铁沉积家兔病理分级0级2只，I级12只，II级17只(1只结果缺失)。实验全程正常对照组白兔心肌、肝内未见铁颗粒沉积(图2D)。

注：A：实验组白兔(2周)，心肌内可见散在细小的铁染色颗粒。 B：实验组白兔(16周)，心肌内可见较多块状的铁染色颗粒。 C：实验组白兔(8周)，几乎所有肝窦及肝细胞内均可见大量颗粒状、块状铁染色颗粒沉积。D：对照组正常白兔心肌内未见铁染色颗粒。图2 各组兔肝、心肌组织普鲁士蓝染色(× 400)Note: A， Rabbits in the experimental group (2 weeks)， scattered fine iron staining particles can be seen in the myocardium. B, Rabbits in the experimental group (16 weeks), more massive iron staining particles can be seen in the myocardium. C, Rabbits in the experimental group (8 weeks), a large number of granular and massive iron staining granules were deposited in almost all hepatic sinusoids and hepatocytes. D, No iron staining particles were found in the myocardium of normal rabbits in the control group.Figure 2 Prussian blue staining of rabbit liver and myocardial tissues in each group (×400)

2.2 实验组白兔的CIC、LIC、SI和注射铁总量之间的关系

如图3所示，CIC与LIC之间高度相关(r=0.712，P< 0.001；图3A)；注射铁总量与CIC之间中度相关(r=0.698，P< 0.001；图3B)，与LIC之间高度相关(r=0.866，P< 0.001；图3C)；SI与注射铁总量之间无相关(r=0.205，P=0.277；图3D)，与CIC之间中度相关(r=0.415，P=0.022；图3E)，与LIC之间无相关(r=0.170，P=0.370；图3F)。

2.3 实验组白兔与对照组白兔CIC、LIC的关系

32只实验组白兔随着注射铁剂时间的增加，心、肝铁浓度总体呈上升趋势。8只正常对照组白兔心、肝铁浓度不随实验周数的增加而上升。与对照组白兔相比，实验组白兔心铁和肝铁浓度明显增加，差别均具有统计学意义(表1)。

图3 32只实验组白兔的CIC、LIC、SI和注射铁总量之间的散点图Figure 3 Scatter plots between CIC, LIC, SI and total iron injection of 32 rabbits in the experimental group

表1 实验组与对照组心肌、肝铁浓度的比较
Table 1 Comparison of cardiac iron concentration (CIC) and liver iron concentration (LIC) between experimental group and control group

心肌铁浓度(mg/g干重)Cardiac iron concentration (mg/g dry weight)肝铁浓度(mg/g干重)Liver iron concentration (mg/g dry weight)实验组(n=32)Experimental group(n=32)对照组(n=8)Control group(n=8)实验组(n=32)Experimental group(n=32)对照组(n=8)Control group(n=8)中位数Median1.2350.21547.2500.675最大值Maximum2.3400.30079.8000.840最小值Minimum0.2000.2008.2100.410z-4.059-4.328P< 0.001< 0.001

3 讨论

3.1 建立心肌铁超负荷动物模型的意义

铁超负荷是铁元素在体内的异常蓄积。大量的铁在重要脏器组织内沉积，尤其是肝[14]、脾、胰腺和心脏等，导致各个脏器功能障碍和结构损伤[15]。铁过载所致心肌病仍然是铁超负荷患者发病率和死亡率的最主要原因[11,16]。心内膜活检的风险大、心肌铁沉积位置分布不均、重复性差，心肌活检常常不能取到铁沉积所在的组织，导致活检结果出现阴性的可能。目前，心脏铁超负荷诊断和治疗的研究进展缓慢，关于这方面的报道较少。因此建立心肌铁超负荷的动物模型对深入研究铁过载对心脏的影响和机制有着重大意义。

3.2 制作心铁超负荷动物模型

目前，国内外常用的铁沉积动物模型办法包括三种：第一种是注射铁剂法[17]，第二种是羰基铁饲料饲养法[18]，第三种是基因剔除敲除法[19]。第二种操作简单、方便、死亡率低，长期让动物进食含有羰基铁饲料致使铁主要沉积在肝，缺点是造模时间长。第三种基因敲除法通过基因敲除特定的铁代谢基因，使动物铁代谢紊乱，优点是为铁代谢和新药治疗提供新的一个新的动物模型，缺点是基因敲除动物价格高而且存活率低。第一种办法造模成功率高，操作较为简单，通过肌肉注射铁剂或者皮下注射铁剂，可以在短期内、大规模制作大量的铁超负荷动物模型。采用注射铁剂的方法，需要根据实验动物对铁中毒的耐受力，所需造成铁沉积的目标脏器和注射药物的剂量等不同而采用不同的注射方式。肝、脾和骨髓等网状内皮系统是铁沉积第一站。在铁超负荷状态下，循环血液中的转铁蛋白逐渐饱和，非转铁蛋白结合铁(non-transferrin-bound iron，NTBI)出现。NTBI是一种不稳定、有高度细胞毒性的物质，其进入心肌细胞，导致心肌的可变铁水平增高，最后以铁蛋白及含铁血黄素形式沉积存在。本研究铁沉积的器官是心脏，根据体内铁沉积规律，要造成心肌铁沉积，必须在短期内使血液中转铁蛋白饱和，因此必须加大注射铁剂量。文献报道通过肌肉注射铁剂(剂量为15 mg/kg)利用家兔可以建立肝铁超负荷模型[20-21]，但是要造成心肌铁沉积注射铁剂量太大，肌肉反复注射家兔难以耐受，容易死亡。采用静脉及腹腔注射，铁吸收快，但易致急性毒性反应，再者易感染，家兔死亡率增高。本研究采用家兔颈背部皮下注射，因为右旋糖酐铁分子较大，须由淋巴管吸收再入血液，所以皮下注射后铁浓度提高相对较慢，短期铁毒性小，家兔易耐受。

人类缺乏铁排泄机制，心肌中沉积的铁主要以铁蛋白和含铁血黄素的形式存在。然而，大多数其它哺乳动物却能以不同的速度排出体内多余的铁[22]。因此，难以选择适合的动物建立完全模拟人体组织铁沉积过程的模型。目前，国内外关于实验动物的选择上尚未达成共识，如：小鼠、大鼠[23]、白兔等。对于建立心肌铁沉积动物模型注射铁剂量的选择，文献报道的有200 mg/kg(低剂量)、400 mg/kg(中等剂量)和800 mg/kg(高剂量)三种[17,24-25]。为了探讨铁剂注射剂量对成模的影响，预实验我们首先按照400 mg/kg及800 mg/kg的剂量注射右旋糖酐铁，每周皮下注射1次。注射4 ～ 6次后，家兔全部死亡，解剖病理示肝、脾内重度铁沉积，但是心肌仅为轻度铁沉积，考虑原因可能为铁过量导致家兔急性中毒死亡，因为文献报道的剂量标准是依据沙鼠等啮齿动物而定，鼠类的耐受力要强于家兔。整合文献资料，在保证心肌铁超负荷的造模目的，同时减少因为注射过多铁剂导致的过高死亡率[25]。本实验选择新西兰白兔作为实验对象，通过白兔后颈背部皮下注射右旋糖酐铁，按200 mg/kg体重注射右旋糖酐铁，每周注射1次。在造模的过程中，发现注射铁剂后的白兔进食量减少，活动减少，体重有所减轻。与注射铁剂前体重相比，体重变化无统计学意义。研究显示最好模拟人类铁沉积机制的动物是沙鼠[25]。常规选择啮齿动物，因为这些都是常用的实验动物。选择家兔，主要考虑到对于一些需要手术、影像成像的研究，体型大的动物优于小的。本次实验通过铁含量检测、病理，从病理上可以证明家兔铁颗粒首先沉积在心肌间质，再进入细胞实质，和人类相反。

3.3 白兔心肌铁超负荷模型的病理改变

本研究通过每周给白兔皮下注射右旋糖酐铁，成功建立了白兔心肌铁超负荷模型。白兔注射右旋糖酐铁1周后，病理切片显示兔心肌未见铁沉积(0级)。此时CIC达到0.295 mg/g，兔肝窦内有大量铁沉积，少部分肝细胞内可见铁沉积颗粒(0级)。白兔注射右旋糖酐铁2周后，病理切片显示心肌内可见散在细小的铁颗粒，分布范围< 50%(I级)此时CIC达到0.70 mg/g。白兔注射右旋糖酐铁16周后，病理切片显示心肌内可见较为弥漫的铁颗粒沉积，分布范围50% ～ 75%(II级)此时CIC达到1.24 mg/g，可见心肌细胞中的铁染色颗粒增多与CIC增加呈正相关，提示在临床中测CIC可反映心脏铁沉积的病理变化。第2周开始几乎所有肝窦及肝细胞内见大量铁颗粒，受累阳性细胞约100%(III级)。白兔铁超负荷模型肝和心脏可见大量分布的铁颗粒沉积，这和临床铁超负荷患者肝、心脏铁颗粒沉积是一致的。

本研究结果显示，CIC与LIC之间高度相关(r=0.712，P< 0.001)，提示随着LIC的增加，铁剂在心脏的沉积程度也随着加重，认为在不能进行心脏活检的情况，可以通过LIC在一定程度上预测预报心脏的铁超负荷情况。CIC与SI之间中度相关(r=0.415，P=0.022)，提示随着SI的增加，铁元素在心脏的沉积程度也逐渐升高，认为在一定程度上SI可以预测心脏的铁超负荷程度。CIC与注射铁总量之间中度相关(r=0.698，P< 0.001)，认为CIC与LIC之间的相关性更高。

本实验过程中，用双蒸水反复清洗心脏、肝内残存血液，标本烘干后再送检，测定标本的CIC和LIC，得到了标本干重的铁浓度。由于没有记录新鲜心脏和肝的重量，因此在得到标本CIC和LIC后，无法计算心、肝的铁摄取总量，不能得到注射铁剂的器官摄取率。这是本研究的不足之处。

综上所述，通过后颈背部皮下注射右旋糖酐铁，可以成功建立心肌铁超负荷兔模型，为铁超负荷对心肌损害的发病机理及诊断、治疗疗效评估等研究提供模型。