贵州油茶炭疽病Colletotrichum kahawae 病原鉴定研究

秦绍钊 张柱亭 王 洪 李御企

（凯里学院，贵州 凯里 556011）

油茶（Camellia oleifera）作为世界四大木本油料作物之一，属山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia），是中国特有的木本油料作物[1]。炭疽菌属（Colletotrichum Corda）可以为害油茶、苹果等190 种以上的植物，是重要的植物病原真菌[2]。油茶炭疽病主要为害油茶的花、叶、果实及枝梢，严重时能引起落果、落蕾、枝梢枯死，甚至整株死亡，造成重大的经济损失[3～4]。在油茶炭疽病发病的典型区域，由炭疽病引起的落蕾达到26%～45%，晚期病果虽然可以采收，但种子含油量不高，约为健康油茶种子的1/2，有的甚至更低[5]。

2019 年上半年贵州已完成油茶新造面积12806.67hm2，低改面积14513.33hm2。近年来，随着油茶种植面积的扩大和良种使用率的提高，贵州油茶的病害问题日趋严重。多年的林间观测结果表明，为害贵州油茶病害的主要病征多为黑褐色病斑，常造成落叶，致使油茶树减产，甚至死亡，给油茶产业发展造成了巨大经济和生态损失[6]。帅小春等，2019 年报道的多基因鉴定方法不利于基层检测工作开展[7]。

本研究所构建最大简约法（MP）和最大似然法（ML）2 种系统发育树取得一致结果，检测方法更加简捷、有效，有利于与基础研究工作的快速开展。本研究通过形态及分子鉴定等方法系统鉴定引起贵州油茶炭疽病种类，旨在为当地抗病种质的选育及油茶病害防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2017～2018 年期间，对黔东南州黎平县、锦屏县及黄平县；铜仁市玉屏县、石阡县及松桃县油茶种植区病害情况进行了详细调查统计。根据其病征（如图1），从贵州省油茶示范园区内采集典型炭疽病病叶，带回实验室，PDA 培养3d，4℃保存，进行病原菌分离检测。

图1 A 和B 分别油茶炭疽病病叶的正反面

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离纯化。常规组织分离法：先用75%的酒精处理病健交界的组织，0.1%升汞溶液消毒，无菌水漂洗干净，PDA 培养基纯化培养，置于4℃下保存备用。

1.2.2 病原菌的形态鉴定。取5mm 菌饼，在PDA 平板28℃黑暗12h 培养，2～5d 连续观察菌落的形态、颜色。取10μL 分生孢子悬浮液在光学显微镜下观察记录其大小及形态特征。

1.2.3 分子鉴定与系统发育分析。取20 mg 菌丝经液氮研磨，样品DNA 提取用生工生物工程（上海）股份有限公司的试剂盒，Ezup 柱式真菌基因组DNA 抽提试剂盒SK8259。扩增引物 如 下：ITS15’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’，ITS45’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’。将测序 rDNA-TS1 和 rDNA-TUB2 序列与GenBank 中相关序列分别用ClustalX1.83软件进行比对分析。选出与各分离菌株相似度较高的相应序列，采用MEGA7.0.14 软件中的最大简约法（MP）和最大似然法（ML）做聚类分析，把所有的碱基状态处理为无序，并给以相同的权重。自举检验重复1000 次以获得各分支的支持率，构建邻近法（NJ）系统发育树。

2 结果与分析

2.1 病原菌菌落与形态特征

代表菌株KLXY-15-1 在 标准PDA 培养基上生长7d，菌落直径为85～95mm，菌落边缘整齐，中间散布深灰色辐射状色素，边缘为灰白色，气生菌丝浓密棉絮状（如图2），菌落背面散布不规则、辐射状的黑色沉积（图3）。

图2 KLXY-15-1 培养基上的菌落

图3 KLXY-15-1 的分生孢子

分生孢子形成在菌丝基部，大小为（14.8～19.5）μm×（5.0～5.8）μm，直圆筒状，通常稍向基部逐渐变细（如图3），这些特征与卡哈瓦炭疽菌（C.kahawae）特征一致。

2.2 分子鉴定

本研究6 个分离菌DNA 为模板，对其核糖体转录间隔区（ITS）和微管蛋白（TUB2）基因进行扩增并测序。NCBI Blastn 比对后确定6 个菌株同属于炭疽菌属卡哈瓦炭疽菌，与形态学鉴定结果一致。代表菌株KLXY-15-1 的ITS 基因序列与其它同属菌株序列经最大简约法（MP）和最大似然法（ML）共同构建的系统发育树中，KLXY-15-1 序列与卡哈瓦炭疽菌（C.kahawae）菌株MG717320.1 聚类结果一致，聚为一个独立的进化分支，能与同属其它菌株明显区分开。因此，根据分离所得鉴定结果将KLXY-15-1 等6 个菌株鉴定为Colletotrichum kahawae。

3 结论与讨论

本研究所利用的最大简约法（MP）中和最大似然法（ML）聚类分析结果一致，KLXY-15-1 炭疽菌形成2 个大的聚类群，表明试验鉴定结果真实有效，能够在卡哈瓦炭疽菌快捷、高效的基础研究鉴定工作中提供理论基础。

近几年，油茶是贵州省重点打造的特色产业之一，现培育有“黔金果”“三山谷”“梵真坊”等26 个油茶品牌。在贵州以扩大油茶基地规模、提高低产林质量、提升油茶精深加工水平为重点，带动油茶产业的高速持续发展过程中，病害对产业的危害程度日益加重，病原物的鉴定方法需要进一步总结与规范，多基因的系统遗传学能够提供较准确和可信的结果，并能够真正的解决分类鉴定上存在的问题。