Res对吸烟致COPD模型大鼠肺泡巨噬细胞分泌相关因子和表面标记物的影响研究

李 珠，孙武装，闫晓婧

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)是临床常见的慢性进展性呼吸系统病症，以持续气流受限为主要病理表现[1]。临床普遍认为，COPD发病与吸烟、职业性粉尘、化学物质、空气污染等有关[2]。近年来，COPD的发病率、病死率呈上升趋势[3]。肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage， AM)是一种广泛存在于肺泡内和支气管表层的炎性细胞，在抗菌、免疫调节、炎性反应等方面起着重要作用，而AM过度释放白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)及基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)等细胞因子是COPD肺组织损伤的关键[4]。当前治疗COPD主要为对症治疗或缓解气道炎症治疗，但二者均不能有效改变肺功能渐进性下降和气道炎症。近年抗细胞因子治疗取得了较好效果。白藜芦醇(Res)是一种主要存在于葡萄等水果中的多酚类化合物[5-7]。研究证实，Res有着良好的抗炎、抗菌、抗氧化及抑制细胞因子等作用[8-9]。巨噬细胞可分为M1型和M2型，M1型巨噬细胞可产生促炎细胞因子，M2型巨噬细胞可增强细胞因子的分泌，二者在COPD中的作用机制是目前临床研究的重点。本文主要通过对比分析不同剂量Res干预对吸烟致COPD模型大鼠AM中IL-6、TNF-α、MMP-9、TIMP-1及相关表面标记物的影响，探讨相关细胞因子及表面标记物在COPD中的作用机制，以更好地指导临床治疗。

1 材料与方法

1.1 实验动物 75只SD新生大鼠及饲料购于河北医科大学实验动物中心,实验动物许可证号：SCXK2018-0019；雌38只，雄37只；生长龄5.1～6.3(5.2±0.3)个月；体质量250.8～260.4(254.3±5.6)g。SD大鼠由专人饲料喂养，相同喂养方法(自由饮食)，饲料和用水新鲜无污染。

1.2 研究方法

1.2.1 分组：采用随机数字表法将所有SD新生大鼠分为研究A组、研究B组、研究C组及研究D组和对照组，每组各15只。研究A组：雌8只，雄7只；生长龄5.6～5.8(5.7±0.2)个月；体质量255.9～258.0(256.7±20.3)g。研究B组：雌8只，雄7只；生长龄5.0～5.9(5.5±0.6)个月；体质量256.3～259.8(256.2±31.2)g。研究C组：雌7只，雄8只；生长龄5.4～5.8(5.6±0.5)个月；体质量255.3～257.5(256.2±26.7)g。研究D组：雌8只，雄7只；生长龄5.5～6.0(5.7±0.3)个月；体质量256.0～258.2(257.2±18.4)g。对照组：雌7只，雄8只；生长龄5.3～5.9(5.5±0.1)个月；体质量252.7～256.1(255.0±33.8)g。5组SD新生大鼠在雌雄比例、生长龄及体质量等方面比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本实验通过动物保护和使用委员会审查并获得批准开展。

1.2.2 造模：5组SD新生大鼠均进行2周的适应性饲养后，通过点燃香烟吸入烟雾的方式制作COPD模型。具体操作：备好1个规格为100 cm×80 cm×80 cm的密闭式熏箱，在每个侧壁留制1个2.5 cm×2.5 cm的窗孔，然后把选取的大鼠放入箱内；采用被动吸烟法：箱内每次同时点燃4支香烟(江西中烟生产的金圣牌软包装香烟，焦油含量11 mg，烟碱量1.0 mg，烟气一氧化碳量12 mg)，当香烟燃烧完毕、烟雾消失后，开启箱盖5 min后继续点燃4支香烟，循环进行，点燃12支香烟后去除大鼠，清洗烟箱。每日2次，每次间隔6 h以上，持续6个月。6个月后手术取大鼠右肺上叶组织条，经40 g/L多聚甲醛固定过夜，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜观察病理切片发现支气管纤毛呈倒伏，且杯状细胞增生，分泌物增加，支气管管壁下炎性细胞明显增多，肺泡腔明显扩大，肺泡壁断裂，肺泡融合，见显著肺气肿，同时肺泡间隔水肿增宽，成纤维细胞增生，小气道平滑肌增殖紊乱，血管腔狭窄，即为COPD造模成功。5组大鼠均造模成功。

1.2.3 纯化AM：各组均行AM纯化。

1.2.3.1 肺泡灌洗液采集：使用95.0%乙醇浸泡3～5 min处死大鼠，剪开颈部皮肤，妥善分离气管，再用丝线于环状软骨下妥善结扎。应用7号小儿头皮针置入气管内，用丝线固定。2 ml注射器抽RPMI 1640培养液1.2 ml，缓慢推入气管(最好先回抽肺残留气体)，停留1 min后逐步回抽，得回收液约1 ml。将回收液注入带塞离心管内。上述操作重复10次。将取得的液体在2000 r/min条件下离心10 min后弃去上清液，制成单细胞悬液，细胞浓度调控在1.5×106/ml。

1.2.3.2 AM纯化：把上述得到的单细胞悬液2 ml、琼脂培养液7 ml及大鼠血清1 ml加入到25 ml的培养瓶中，充分混匀后放入37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱内持续孵育2.5 h，使AM贴壁。将非贴壁细胞去除后，加乙二胺四乙酸二钠10 ml。30 min后回收贴壁细胞，2000 r/min离心10 min，应用培养液洗涤3次，将细胞浓度调控在1.5×106/ml，即获得纯化后的AM液。

1.2.4 Res预处理

1.2.4.1 研究组：取研究A组、B组、C组及研究D组AM纯化液，用传代3次的AM细胞接种于96孔板内，稳定3 d，分别加入50、100、150、200 mol/L Res(杭州瑞树生化有限公司生产)预处理12 h。

1.2.4.2 对照组：取对照组AM纯化液，用传代3次的AM细胞接种于96孔板内，稳定3 d，不行Res预处理。

1.3 主要仪器设备 Trizol RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒(美国Invitro-den公司生产)；NF-κB基因引物(上海生物工程公司合成)；聚合酶链式反应(PCR)检测仪(美国Bio-Rad公司生产)；ChemiDoc XRS凝胶图像分析系统(美国Bio-Rad公司生产)；MR Ⅲ型酶标仪(美国Hyperion公司生产)。

1.4 观察指标 对比观察5组SD大鼠Res不同时间(4、6、12 h)干预下细胞因子(IL-6、TNF-α、MMP-9、TIMP-1)和M1型巨噬细胞的表面标记物CD11c、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、M2型巨噬细胞表面标记物精氨酸酶1(Arg-1)、CD206)表达的水平。

1.4.1 IL-6、TNF-α、MMP-9及TIMP-1测定：于Res干预4、6、12 h时提取5组96孔板内的待测AM纯化液，采用酶联免疫吸附法检测5组大鼠IL-6、TNF-α、MMP-9及TIMP-1水平。试剂盒购自美国R&D公司，采用Hyperion MR Ⅲ型酶标仪测定。

1.4.2 巨噬细胞表面标记物测定：于Res干预4、6、12 h时提取96孔板内的待测AM纯化液，用Trizol法提取AM贴壁细胞总RNA，以总RNA为模板将总RNA反转录合成cDNA，设计基因引物，用Real-time PCR SYB Green行荧光定量PCR检查检测基因表达水平，以β-actin作为内参照，基因表达相对倍数变化用2-ΔΔCt计算。

2 结果

2.1 5组大鼠不同Res干预时间AM中IL-6水平比较 干预4、6 h时各组大鼠AM中IL-6含量比较差异均无统计学意义(P>0.05)，干预12 h时随着Res干预剂量的增大AM中IL-6含量随之降低，差异有统计学意义(P<0.01)。随着Res干预时间的延长5组大鼠AM中IL-6含量均升高，而且在干预12 h时达峰值，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表1。

表1 SD大鼠慢性阻塞性肺疾病5组不同剂量白藜芦醇不同干预时间肺泡巨噬细胞中白细胞介素6水平比较

注：研究A、B、C、D组分别为予白藜芦醇50、100、150、200 mol/L干预的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠组，对照组为未予白藜芦醇干预的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠组；与同组干预4 h比较，aP<0.05，bP<0.01;与同组干预6 h比较，cP<0.05

2.2 5组大鼠不同Res干预时间AM中TNF-α水平比较 相同干预时间，AM中TNF-α水平对照组>研究A组>研究B组>研究C组>研究D组，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。对照组及研究A组、B组、C组、D组AM中TNF-α水平在干预4 h后逐步升高，到6 h时达峰值，随后下降，干预12 h时除研究B、C、D组下降至干预4 h时水平，余组内不同时间点两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 5组SD慢性阻塞性肺疾病大鼠不同剂量白藜芦醇不同干预时间肺泡巨噬细胞中肿瘤坏死因子α水平比较

注：研究A、B、C、D组分别为给予白藜芦醇50、100、150、200 mol/L干预的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠组，对照组为未给予白藜芦醇干预的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠组；与同组干预4 h比较，aP<0.05；与同组干预6 h比较，cP<0.05

2.3 5组大鼠不同Res干预时间AM中MMP-9比较 相同干预时间，AM中MMP-9水平对照组<研究A组<研究B组<研究C组<研究D组，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。对照组及研究A组、B组、C组、D组AM中MMP-9在干预4 h后逐步升高，到6 h时达峰值，随后下降，组内不同时间点两两比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表3。

表3 5组SD慢性阻塞性肺疾病大鼠不同剂量白藜芦醇不同干预时间肺泡巨噬细胞中基质金属蛋白酶9比较

注：研究A、B、C、D组分别为予白藜芦醇50、100、150、200 mol/L干预的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠组，对照组为未予白藜芦醇干预的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠组；与同组干预4 h比较，aP<0.05，bP<0.01；与同组干预6 h比较，cP<0.05

2.4 5组大鼠不同Res干预时间AM中TIMP-1水平比较 相同干预时间，研究A组、B组、C组、D组均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，但研究A组、B组、C组、D组间AM中TIMP-1水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；对照组及研究A组、B组、C组、D组AM中TIMP-1水平在干预4 h后逐步升高，干预6 h时达峰值，随后下降，组内不同时间点两两比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表4。

表4 5组SD慢性阻塞性肺疾病大鼠不同剂量白藜芦醇不同干预时间肺泡巨噬细胞中基质金属蛋白酶抑制剂1水平比较

注：研究A、B、C、D组分别为予白藜芦醇50、100、150、200 mol/L干预的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠组，对照组为未予白藜芦醇干预的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠组；与同组干预4 h比较，aP<0.05，bP<0.01;与同组干预6 h比较，cP<0.05

2.5 5组大鼠不同Res干预时间巨噬细胞表面标记物水平比较 相同干预时间，随着Res干预剂量的增加，CD11c、iNOS表达明显减弱，Arg-1、CD206表达明显增强，差异均有统计学意义(P<0.05)；且同组内随着Res干预时间的延长CD11c、iNOS表达逐渐减弱，Arg-1、CD206表达逐渐增强，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5。

3 讨论

吸烟是COPD一个主要的致病因素，在长期吸烟过程中，烟雾所含的有害颗粒、氧化物质会对支气管黏膜纤毛系统造成直接性损伤，引发支气管痉挛，进而导致呼吸道防御、自净等功能减弱。烟雾刺激还会诱导活化中性粒细胞、巨噬细胞及嗜酸粒细胞释放多种蛋白酶，而且会抑制抗蛋白酶类物质的生成，如此导致蛋白酶/抗蛋白酶失衡，同时还会释放大量的氧自由基、氧化产物破坏与降解大量细胞外基质，致使弹性纤维断裂，进而造成肺组织逐步破坏而形成肺气肿。此种炎性细胞与炎性因子网络在烟雾的诱发下会产生相互作用，加快肺组织破坏及气道重塑，进而让气流阻塞呈进展性变化，最终发展成COPD。

表5 5组SD慢性阻塞性肺疾病大鼠不同剂量白藜芦醇不同干预时间肺泡巨噬细胞表面标记物水平比较

注：研究A、B、C、D组分别为给予白藜芦醇50、100、150、200 mol/L干预的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠组，对照组为未给予白藜芦醇干预的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠组；与同组干预4 h比较，aP<0.05;与同组干预6 h比较，cP<0.05

炎性反应是COPD主要病理改变，中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞参与其的发生、发展。近年研究表明，AM活化可能是COPD发生、发展的重要途径[10]。AM活化后会产生TNF-α、MMP-9等多种活性介质，引起炎性细胞聚集，并浸润肺脏导致肺损伤。氧化/抗氧化失衡已被证实是COPD肺损伤的主要病理机制，提示氧化应激和COPD的发生、发展有着密切的关系。抗氧化剂能有效改善患者的肺功能，且可延缓肺功能损伤，提升患者生活质量[11]。

研究发现，Res对COPD大鼠有着良好的抗氧化作用，这可能和降低有丝分裂原活化蛋白激酶家族中的应激蛋白p38、ERK及JNK磷酸化水平，进而抑制炎性蛋白酶释放有关[12]。具体而言，就是Res通过降低机体促炎因子水平、提升内源性巯醇抗氧化物水平，进而对COPD模型大鼠的肺组织产生良好的抗氧化、抗炎作用。还有研究证实，Res可有效抑制COPD大鼠氧分压的降低，提升用力呼气量/用力肺活量比值，减少肺泡灌洗液中细胞间黏附分子21含量，降低肺湿/干重比，进而减轻肺组织损伤[13]。此外，还有研究发现Res对COPD患者外周血单核细胞DNA氧化损伤有着良好的体外修复作用，且对肺损伤有良好的保护作用[12]。

TNF-α是一种内源性细胞因子，可激活中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等促炎因子释放。临床研究表明，TNF-α可通过本身致炎作用和活化其他炎性细胞因子基因转录导致气道炎性反应[14]。IL-6是诱导急性期炎性反应，其可通过激活蛋白水解促进肌肉分解代谢。同时，IL-6可活化NF-κB抑制肌纤维蛋白合成，导致COPD患者分解代谢增强，合成代谢减弱，进而造成患者恶病质。MMP-9是基质金属蛋白酶家族(matrix metallo proteinases, MMPs)重要成员，MMPs可促进炎性细胞浸润，致细胞外基质分解，破坏血管内皮、气道上皮基底膜，使炎性细胞游出并聚集于靶细胞[15]。而TIMP-1是MMP-9重要的天然抑制剂，可特异性抑制MMP-9活性，促进成纤维细胞增生和胶原合成，致胶原细胞于肺泡壁过度沉积。当前研究表明，TIMP-1可反映气道组织修复情况，是气道重塑的一个重要标志物[16]。MMP-9与TIMP-1保持一定的动态平衡，以便维持细胞外基质的合成和降解平衡，而该机制一旦被打破则会导致细胞外基质代谢紊乱，胶原沉积、气道重塑形成[17]。本结果显示：随着Res干预时间的延长5组大鼠AM中IL-6含量均升高，且在干预12 h时达峰值，干预12 h时随着干预剂量的增大AM中IL-6含量随之降低；相同干预时间，AM中TNF-α水平对照组>研究A组>研究B组>研究C组>研究D组，MMP-9水平对照组<研究A组<研究B组<研究C组<研究D组，研究A组、B组、C组、D组AM中TIMP-1水平均高于对照组；对照组及研究A组、B组、C组、D组AM中TNF-α、MMP-9、TIMP-1水平在干预后4 h后逐步升高，6 h时达峰值，随后下降。可以认为有效剂量的Res能控制上述细胞因子分泌，与相关报道结果基本一致[18]。由此表明，Res对吸烟致COPD模型大鼠AM中IL-6、TNF-α、MMP-9、TIMP-1有着积极的影响。

巨噬细胞可分为经典激活、发挥促炎作用的M1型和替代活化、发挥抗炎作用的M2型。M1型巨噬细胞可产生促炎细胞因子，被称为经典型巨噬细胞，具有很强的杀死微生物特性，但这种特性容易引起组织破坏。M2型巨噬细胞可增强白细胞介素1β、TNF-α、白细胞介素12和白细胞介素18等细胞因子的分泌。本结果显示，相同干预时间，随着Res干预剂量的增加，CD11c、iNOS表达明显减弱，Arg-1、CD206表达明显增强；且同组内随着Res干预时间的延长CD11c、iNOS表达逐渐减弱，Arg-1、CD206表达逐渐增强。提示Res的应用有助于改善COPD模型大鼠病情。

综上所述，Res对吸烟致COPD模型大鼠AM中IL-6、TNF-α有良好的抑制作用，并可促进MMP-9、TIMP-1分泌，明显减弱M1型巨噬细胞表面标记物的表达，加强M2型巨噬细胞表面标记物的表达，有助于改善模型大鼠病情。