小构树总黄酮提取工艺优化及其抗氧化、美白活性

张意笠，胡培豪，黄 真，程汝滨，钟晓明

（浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）

小构树Broussonetia kazinokiSieb.et Zucc.为桑科构属落叶灌木，别名楮皮、葡蟠、女谷等，主要分布在我国华东、华南地区及日本，资源丰富，在林业、农业方面有广泛应用［1］。《中华本草》 记载，小构树叶具有清热解毒、祛风止痒、敛疮止血等作用［2］；小构树根提取物被2015 年版《已使用化妆品原料名称目录》 收载，显示出该植物在化妆品领域具有一定的开发利用价值。

黄酮在植物界中广泛存在，为色原烷或色原酮衍生物，是以α-苯基苯并吡喃酮为主体的一系列物质总称［3-4］，具有许多药理活性，在医药、食品、化妆品等行业得到广泛应用［5］，王中晓［6］研究显示，银杏叶总黄酮对心肌缺氧性损伤有明显保护作用；汪光华等［7］报道，从高良姜中提取纯化得到的高良姜素、山柰素、山柰酚、槲皮素均对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用；方向等［8］从苦荞萌发物中提取出苦荞黄酮，发现它在整个紫外波段均有较强的吸收。另外，它也是构属植物主要化学成分之一，具有良好的生物活性。Lim等［9］发现，小构树根皮提取物异戊二烯型黄酮Kazinol U 可减少黑色素生成，改善色素沉着；贾东辉等［10］报道，构树叶醇提物中的成分主要为黄酮类，具有一定的抗氧化活性，并且存在量效关系。

目前，对构属植物的研究主要集中在构树，而对同属成员小构树缺少相关报道。小构树为资源丰富、分布广泛、来源廉价的药用植物，但其总黄酮提取工艺落后，提取效率较低，同时尚无系统活性评价。因此，本实验采用Box-Behnken 响应面法优化小构树总黄酮提取工艺，并评价该成分抗氧化、美白活性，以期促进该资源和相关产品的深入开发利用。

1 材料

1.1 仪器 DZF 数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）；AL104 电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；RE-52AA 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；恒温水浴锅（上海宜昌仪器纱筛厂）；紫外分光光度计（日本岛津公司）；BLX-800 酶标仪（美国BioTek 公司）。

1.2 试剂与药物 小构树根采自浙江省杭州市，经浙江中医药大学药学院中药资源研究所陈孔荣副教授鉴定为桑科构属小构树Broussonetia kazinokiSieb.et Zucc.的干燥根。芦丁对照品（B20771-100 mg，纯度≥98%，批号T27F10Z81699）、1，1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）（S30629-250 mg，纯度 98%，批号 W27F10E81251）、L-酪氨酸（S20087-25 g，批号 J30M10R84464）、L-多巴（S20191-25 g，批号 O25M8K3214）、熊果苷（B21402-20 mg，纯度≥98%，批号T17S6B1）（上海源叶生物科技有限公司）；2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）［酷尔化学科技（北京）有限公司，批号54C1201V］；L-抗坏血酸（美国Sigma 公司，批号WXBB4747V）；酪氨酸酶（美国Worthington 公司，批号34A14699Y）。无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、过硫酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含有量测定 参考文献［11］报道的方法。

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取芦丁对照品10.0 mg，75% 乙醇定容至10 mL，摇匀，即得（1.0 mg／mL）。

2.1.2 供试品溶液制备 小构树根粉碎后过50 目筛，精密称取粉末1.0 g，加入20 mL 75% 乙醇，置于70 ℃恒温水浴锅中冷凝回流提取60 min，抽滤，滤液转移至50 mL 量瓶中，定容至刻度，即得。

2.1.3 检测波长选择 取供试品、对照品溶液各1 mL，置于25 mL 比色管中，加5% NaNO2溶液1 mL，混匀后静置6 min，加10%Al（NO3）3溶液1 mL，混匀后静置6 min，再加4% NaOH 溶液10 mL，蒸馏水定容至25 mL，混匀，静置15 min，在200～800 nm 波长处进行扫描，发现上述2 种溶液在510 nm 处均有最大吸收，故选择其作为检测波长。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL 对照品溶液于25 mL 比色管中，按“2.1.3”项下方法处理，以蒸馏水管溶液为空白，在510 nm 波长处测定吸光度。以吸光度（A）对溶液质量浓度（X）进行回归，得回归方程为A＝0.429 2X-0.003 6（R2＝0.999 5），在0.3～1.8 mg／mL范围内呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液适量，按“2.1.3”项下方法平行测定6次吸光度，测得其RSD 为0.8%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验 精密称取小构树根粉末1.0 g，共6 份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下方法测定吸光度，测得其RSD 为1.8%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取“2.1.2”项下供试品溶液，按“2.1.3”项下方法每隔10 min 测定吸光度1 次，持续60 min，测得其RSD 为2.7%，表明溶液在60 min 内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验 取6 份含有量已知的小构树根粉末，精密加入等量芦丁对照品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下方法测定吸光度，测得其平均加样回收率为95.3%，RSD 为2.3%。

2.2 单因素试验 选择乙醇体积分数（55%、65%、75%、85%、95%）、液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1）、提取温度（50、60、70、80、90 ℃）、提取时间（30、60、90、120、150 min）进行单因素试验，平行3 次，考察其对总黄酮得率的影响。

如图1A 所示，总黄酮得率随着乙醇体积分数增大而先升后降，在85% 时达到最大值，但当其过高时可能会使一些醇溶性杂质溶出增多，导致得率反而下降。如图1B 所示，总黄酮得率随着液料比增大而先升后略降，在30∶1 时达到最大值，但其继续增加时得率反而略有降低，可能是由于其他非黄酮类可溶性杂质溶出所致。如图1C 所示，总黄酮得率随着温度升高而先升后降，在80 ℃时达到最大值，但当其过高时可能会使黄酮类成分氧化变性，导致得率下降。如图1D 所示，总黄酮得率随着时间延长而先升后降，在90 min 时达到最大值，但提取时间过短，黄酮类成分溶出不足；提取时间过长，可能会使一些热不稳定成分遭到破坏，导致得率下降。

综上所述，进行响应面分析的各因素水平分别为乙醇体积分数75%、85%、95%，液料比20∶1、30∶1、40∶1，提取温度70、80、90 ℃，提取时间60、90、120 min，最优提取工艺为乙醇体积分数85%，液料比30∶1，提取温度80 ℃，提取时间90 min，总黄酮得率为52.36 mg／g。

图1 各因素对总黄酮得率的影响Fig.1 Effects of various factors on total flavonoids yield

2.3 Box-Behnken 响应面法优化 在单因素试验基础上，以乙醇体积分数（A）、液料比（B）、提取温度（C）、提取时间（D）为影响因素，总黄酮得率为评价指标（Y）进行响应面分析，因素水平见表1，结果见表2。

通过Design-Expert 8.0.6 软件进行拟合，得二阶多项式方程为Y＝51.45+6.00A+3.48B+5.51C-0.031D+1.22AB-0.49AC+0.68AD+4.34BC-4.83BD+0.15CD-5.50A2-6.71B2-7.50C2-3.59D2，方差分析见表3。由此可知，决定系数R2＝0.982 2，修正相关系数＝0.964 4，模型F＝55.2，P＜0.000 1，表明模型有极显著意义；失拟项P＞0.05，表明模型与数据拟合程度良好；A、B、C、BC、BD、A2、B2、C2、D2对总黄酮得率有极显著影响（P＜0.000 1），各因素影响程度依次为乙醇体积分数＞提取温度＞液料比＞提取时间。响应面分析［12-13］见图2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 试验设计与结果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

由此可知，最优提取工艺为乙醇体积分数90.67%，液料比36.03∶1，提取温度85.20 ℃，提取时间79.64 min，总黄酮得率为55.64 mg／g，考虑到实际操作，将其修正为乙醇体积分数90%，液料比35∶1，提取温度85 ℃，提取时间80 min。进行3 次验证试验，测得总黄酮平均得率为55.14 mg／g，与预测值55.64 mg／g 接近，与单因素所得52.36 mg／g 比较提升了5.31%，表明工艺合理稳定，可为后续相关规模化生产奠定基础。

2.4 抗氧化活性实验

2.4.1 DPPH 自由基清除率测定 配制10、20、40、60、80、100、200、400、600、800 μg／mL 总黄酮提取物、L-抗坏血酸溶液，各取1 mL，加入5 mL 0.06 mmol／L DPPH 乙醇溶液，充分混匀后室温下避光反应30 min，于517 nm 波长处测定吸光度。以L-抗坏血酸为阳性对照，平行3 次，计算清除率，公式为清除率＝×100%（A0为1 mL 蒸馏水+5 mL DPPH 乙醇溶液时的吸光度，A1为1 mL样品+5 mL DPPH 乙醇溶液时的吸光度，A2为1 mL 样品+5 mL 无水乙醇时的吸光度），结果见图3A。由此可知，随着总黄酮提取物质量浓度升高，其清除DPPH 自由基的能力逐渐增强，并存在一定量效关系，当其质量浓度为10 μg／mL时清除率仅6.88%，而为400 μg／mL 时达87.77%，IC50为151.70 μg／mL。

图2 各因素响应面图Fig.2 Response surface plots for various factors

2.4.2 ABTS 自由基清除率测定 参考文献［14］报道的方法并加以改进。将7 mmol／LABTS 溶液与2.45 mmol／L过硫酸钾溶液按1∶1 比例混合均匀，室温避光下静置过夜，制备ABTS 贮备液，在12～16 h 内测定，其间用蒸馏水稀释，使其在734 nm波长下的吸光度为0.700±0.020。

配制 60、80、100、200、300、400、600、800 μg／mL总黄酮提取物、L-抗坏血酸溶液，各取0.1 mL，加入3.9 mL ABTS 贮备液，充分混匀，室温下避光反应10 min，于734 nm 波长处测定吸光度。以L-抗坏血酸为阳性对照，平行3 次，按“2.4.1”项下公式计算清除率（A0为0.1 mL 蒸馏水+3.9 mL ABTS 自由基工作液时的吸光度，A1为0.1 mL 样品+3.9 mL ABTS 自由基工作液时的吸光度，A2为0.1 mL 样品+3.9 mL 蒸馏水时的吸光度），结果见图3B。由此可知，随着总黄酮提取物质量浓度升高，其清除ABTS 自由基的能力逐渐增强，并存在一定量效关系，当其质量浓度为60 μg／mL时清除率仅13.11%，而为600 μg／mL 时接近100%，IC50为242.20 μg／mL。

2.5 美白活性实验 参考文献 ［15］报道的方法。

图3 样品对DPPH、ABTS 自由基的清除率Fig.3 Scavenging rates of samples on DPPH and ABTS free radicals

2.5.1 单酚酶抑制活性测定 在96 孔酶标板上加入L-酪氨酸（2.5 mmol／L）溶液50 μL 及总黄酮提取物、熊果苷溶液（10、20、40、60、80、100、150、200 μg／mL）各25 μL，混匀后37 ℃下孵育10 min，加入酪氨酸酶（250 U／mL）溶液50 μL，混匀后37 ℃下孵育15 min，于475 nm 波长处测定吸光度。以磷酸盐缓冲液（pH＝6.8）为空白对照，熊果苷为阳性对照，平行3 次，计算抑制率，公式为抑制率＝×100%（A1为无供试品溶液，但有酪氨酸酶时的吸光度；A2为既无供试品溶液，也无酪氨酸酶时的吸光度；A3为既有供试品溶液，也有酪氨酸酶时的吸光度；A4为有供试品溶液，但无酪氨酸酶时的吸光度），结果见图4A。由此可知，随着总黄酮提取物质量浓度升高，其对酪氨酸酶单酚酶的抑制能力逐渐增强，并呈剂量依赖性关系，当其质量浓度为10 μg／mL时抑制率仅42.51%，而为80 μg／mL 时达74.69%，并且抑制作用强于熊果苷，总黄酮提取物、熊果苷IC50分别为24.37、15.05 μg／mL。

2.5.2 二酚酶抑制活性测定 在96 孔酶标板上加入L-多巴（2.5 mmol／L）溶液50 μL 及总黄酮提取物、熊果苷溶液（10、20、40、60、80、100、150、200 μg／mL）各25 μL，混匀后37 ℃下孵育10 min，加入酪氨酸酶（250 U／mL）溶液50 μL，混匀后37 ℃下孵育15 min，于475 nm 波长处测定吸光度。以磷酸盐缓冲液（pH＝6.8）为空白对照，熊果苷为阳性对照，平行3 次，按“2.5.1”项下公式计算抑制率，结果见图4B。由此可知，随着总黄酮提取物质量浓度升高，其对酪氨酸酶二酚酶的抑制能力逐渐增强，并呈剂量依赖性关系，当其质量浓度为10 μg／mL 时抑制率仅43.74%，而为60 μg／mL时达68.98%，并且抑制作用强于熊果苷，总黄酮提取物、熊果苷IC50分别为15.64、14.50 μg／mL。

3 讨论

目前，优化植物黄酮提取工艺的方法主要有正交试验、均匀设计、Box-Behnken 法等［16-17］，其中Box-Behnken 法精准性高，可完善正交试验、均匀设计等线性模型中存在的不足［18］，本实验采用该方法优化小构树总黄酮提取工艺，发现优化后得率较单因素试验提高了5.31%，可为后期相关大规模开发应用奠定基础。刘艳清等［19］发现，各因素对总黄酮提取量的影响程度依次为乙醇体积分数＞料液比＞提取时间＞提取温度，而本实验为乙醇体积分数＞提取温度＞液料比＞提取时间，表明在提取黄酮类成分过程中影响较大的因素为乙醇体积分数，故后期可重点关注其对得率的影响。此外，还可将响应面优化与超声-微波提取、酶法提取、电磁裂解等新型提取方法相结合，从而进一步提高得率。

图4 样品对单酚酶、二酚酶的抑制率Fig.4 Inhibitory rates of samples on monophenolase and diphenolase

桑科构属植物中黄酮种类丰富，已从构树叶、果实等部位分离得到多种该类化合物［20-22］。Yang等［23］发现，构树叶中的酚类成分具有良好的清除DPPH、ABTS 自由基能力；Jang 等［24］从构树根皮中得到具有抑制酪氨酸酶活性的成分，有着一定的美白研究价值；另外，构属植物在抑制肿瘤细胞增殖、治疗糖尿病、抑菌等方面也表现出了相关活性［25-26］。

当前在国内外植物化妆品研发过程中发现，抗氧化剂不仅与抗衰老有关，与美白、抗炎等也关系密切，多种具有清除自由基、抑制酪氨酸酶活性的天然成分已得到广泛应用。吴颖等［27］报道，抗氧化、抑制酪氨酸酶活性的强弱程度与桔梗、金盏菊、蒲公英、银杏叶、茶叶中黄酮和总酚含有量高低顺序基本一致，并以茶叶最强。另外，抗氧化剂对减少黑色素合成有重要影响，可能是通过阻断或减弱酪氨酸酶活性、抑制酶表达所致，而本实验发现小构树总黄酮在抗氧化、美白方面均显示出良好的作用，提示自由基可能与其抑制酪氨酸酶活性的机理相关，后续可深入挖掘该成分在细胞、分子水平上的美白机制，以期为该植物综合开发利用提供科学依据。