纤维素酶辅助提取藕节多糖工艺优化及其动力学、热力学研究

王占一，赵 静，朱天顺，胡锦钢，赵春林，向 兰

（1.枣庄学院食品科学与制药工程学院，山东 枣庄 277160；2.山东大学药学院，山东 济南 250012）

莲Nelumbo nuciferaGaertn.为睡莲科莲属水生植物，其干燥根茎节部入药，称为藕节，2015 年版《中国药典》 也有收载［1］，具有收敛止血、清热凉血、通便止泻、健脾益气之功效，用于治疗肺结核咯血、胃出血、鼻出血、吐血、便血等病症。近年来，国内外学者发现藕节中含有大量多酚、生物碱、多糖，其中多糖类成分已引起广泛关注［2-3］。

在天然活性成分的提取过程中，水酶法提取是将生物酶作为一种生物催化剂来破坏植物细胞壁结构，提高细胞膜、细胞壁通透性，降低底物传质阻力，加快细胞中活性物质溶出，该方法操作安全，易于控制，提取效率高，已在生产实践中得到大量应用［4-9］。

天然活性成分从实验材料到提取介质中的溶出过程比较复杂，会受到各种因素的影响，但其本质都是溶质从物料的固相到溶剂的液相转运过程。一般认为，有效成分从物料内部到物料表面扩散的过程是控制该步骤的关键［10］，但纤维素酶法提取多糖类成分时溶质转运过程的动力学、热力学研究尚未见报道。本实验采用响应面法优化纤维素酶辅助提取藕节多糖工艺，通过Fick 扩散公式、Van’t Hoff 方程分析该成分从材料固相到溶剂液相传递过程中的动力学、热力学，为工业化生产提供技术参考，也为药材资源开发利用提供理论依据。

1 材料

藕采自微山湖，手工取其根茎节部后洗净、烘干，经枣庄学院闫志佩教授鉴定为正品。TU-1800SPC 型紫外-可见分光光度计（上海普析通用仪器有限公司）；ALC-1104 型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；GZX-9240MBE 型电热恒温鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；RE-2000A 型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；HH-6 型数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）。葡萄糖对照品（纯度＞98%，批号110833-201805）购自中国食品药品检定研究院；纤维素酶（酶活性≥20 000 U／g）购自郑州宇控生物科技有限公司。3，5-二硝基水杨酸、无水乙醇、碳酸钠、浓硫酸、苯酚、抗坏血酸、磷酸盐等试剂均为分析纯，购自天津市天力化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 多糖含有量测定 采用苯酚-硫酸法［11-12］测定总糖含有量。将D-无水葡萄糖干燥至恒重后精密称取50 mg，小烧杯溶解，置于容量瓶中定容至100 mL，作为葡萄糖贮备液，依次稀释成10、20、30、40、50、60、70 μg／mL，以蒸馏水为对照，各量取1 mL 置于10 mL 具塞试管中，加入5%苯酚溶液0.5 mL，充分振摇后再滴加5.5 mL 浓硫酸，混合均匀，室温下静置30 min，于490 nm 波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标（A），溶液质量浓度为横坐标（X）进行回归，得方程为A＝0.079 2X-0.005 5（r＝0.999 5），在1.43～10 μg／mL范围内线性关系良好。

采用DNS 显色法［13-14］测定还原糖含有量。精密量取0.5 mg／mL 葡萄糖溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于试管中，蒸馏水补至1.0 mL，加入2.0 mL 3，5-二硝基水杨酸（DNS）显色剂，沸水浴5 min，冷却，蒸馏水补至10 mL 后于540 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标（A），溶液质量浓度为横坐标（X）进行回归，得方程为A＝0.017 2X-0.186 2（r＝0.999 3），在5～50 μg／mL 范围内线性关系良好。

再计算总糖含有量与还原糖含有量的差值，即为多糖含有量。

2.2 多糖得率测定 精密称取粉碎至40 目的藕节粉末5.0 g，置于三颈圆底烧瓶中，加入纤维素酶至设定加酶量，加入一定pH 值磷酸盐缓冲液使料液比达到设定值，酶解反应到设定时间，其间温度保持恒定。提取结束后，将提取物转移至烧杯中，沸水浴灭酶10 min，抽滤，定容至250 mL，作为供试品溶液，计算多糖得率，公式为多糖得率＝（多糖含有量／药材质量）×100%。

2.3 单因素试验 本实验考察了加酶量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、料液比（1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶28）、介质pH（2、3、4、5、6、7）、酶解温度（20、30、40、50、60、70 ℃）、酶解时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h）对多糖得率的影响，将其中1 个作为单因素时，其他4 个分别固定为加酶量0.8%、料液比1∶20、介质pH 5、酶解温度50 ℃、酶解时间2.5 h。

2.3.1 加酶量 图1 显示，当加酶量为0.2%～0.8%时，多糖得率随着其增加而升高；超过0.8%后，逐渐趋于平缓，表明已达到饱和状态，考虑到生产成本，确定加酶量在0.8%左右。

图1 加酶量对多糖得率的影响Fig.1 Effect of enzyme consumption on polysaccharides yield

2.3.2 料液比 图2 显示，随着提取溶剂用量增加，多糖得率呈先升后降的趋势，当料液比为1∶20时达到最大值，其原因是提取溶剂用量较大时有利于溶质从固相向溶剂相转移，加速多糖溶出，得率也随之提高；超过1∶20 后，由于后期处理过程中有损耗，导致多糖得率不升反降，故确定料液比在1∶20 左右。

图2 料液比对多糖得率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on polysaccharides yield

2.3.3 介质pH 图3 显示，随着介质pH 升高，多糖得率呈先升后降的趋势，在5 时达到最大值，其原因是磷酸盐缓冲液pH 值对生物酶的影响较大，大于或小于最适pH 值都会降低后者活性，故选择介质pH 在5 左右。

图3 介质pH 对多糖得率的影响Fig.3 Effect of medium pH on polysaccharides yield

2.3.4 酶解温度 图4 显示，当酶解温度为20～50 ℃时，多糖得率随着其增加而逐渐升高，在50 ℃时达到最大值；超过50 ℃后，多糖得率呈降低趋势，其原因是酶解温度过高时生物酶活性受到抑制，不能充分发挥作用，导致其得率降低，故确定酶解温度在50 ℃左右。

图4 酶解温度对多糖得率的影响Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on polysaccharides yield

2.3.5 酶解时间 图5 显示，当酶解时间为1.0～2.5 h 时，多糖得率随着其延长而逐渐升高，在2.5 h 达到最大值；超过2.5 h 后，多糖得率几乎不再提高，考虑到实际生产，确定酶解时间在2.5 h左右。

图5 酶解时间对多糖得率的影响Fig.5 Effect of enzymolysis time on polysaccharides yield

2.4 Box-Behnken 响应面法优化 在单因素试验基础上，采用Design Expert 8.0.5 软件进行Box-Behnken 响应面设计，选择加酶量（X1）、介质pH（X2）、酶解温度（X3）、酶解时间（X4）作为影响因素，多糖得率（Y）作为评价指标，共设立29个处理组，因素水平见表1，结果见表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 试验设计与结果Tab.2 Design and results of tests

通过Design-Expert 8.0.5 软件进行拟合，得二次回归方程为Y＝5.68+0.61X1-0.062X2-0.13X3+0.27X4+0.24X1X2-0.43X1X3-0.36X1X4-0.07X2X3+0.16X2X4-0.38X3X4--0.64，方差分析见表3。由此可知，模型P＜0.000 1，决定系数R2＝0.909 5，失拟项P＞0.05，表明方程拟合情况良好；X1、对多糖得率有极显著影响（P＜0.01），X4、X1X3、X3X4对其有显著影响（P＜0.05）；各因素影响程度依次为加酶量＞酶解时间＞酶解温度＞介质pH。响应面分析见图6。

由此可知，最优提取工艺为加酶量0.9%，介质pH 5.07，酶解温度47.4 ℃，酶解时间2.58 h，多糖得率为5.87%，考虑到实际操作，将其修正为加酶量0.9%，介质pH 5.0，酶解温度47 ℃，酶解时间2.5 h。进行3 次验证试验，测得多糖平均得率为5.86%，与预测值5.87% 接近，表明工艺稳定可靠。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

图6 各因素响应面图Fig.6 Response surface plots for various factors

2.5 提取过程动力学分析 本实验假设整个提取体系温度分布一致，搅拌良好，忽略传质过程中的外部阻力，将原料粉末近似看作球形构造，表面光滑。多糖从固相向溶剂相的溶出只与径向相关，扩散速率通常用Fick 扩散公式描述［15］，为了方便表达，假设Y＝ln ［C∞／（C∞-C）］，完整表达为Y＝kt+ln［π2C∞／6（C∞-C0）］且k＝π2DS／r2（C∞为传质达到平衡时介质中多糖含有量，单位mg／mL；C为t时刻介质中多糖含有量，单位mg／mL；C0为介质中多糖初始含有量，单位mg／mL；k为提取速率常数，单位min-1；DS为表面扩散系数，单位cm2／min；r为近似球形的材料半径，单位cm）。

精密称取40 g 藕节粉末（r约为0.05 cm），设定纤维素酶加入量0.9%，介质pH 5，料液比1∶20，在7 种温度（305、310、315、320、325、330、335 K）下水浴提取，相同条件下另设不加纤维素酶的体系。从开始反应的0.5 h 开始，每隔0.25 h 取样0.5 mL，直至3.5 h 提取完全为止，测定提取样品中多糖含有量，得到多糖得率随提取时间的变化规律，结果见图7。

由此可知，无论是否加入纤维素酶，多糖得率都随着提取时间延长而升高；在最适酶解温度下，加入纤维素酶后多糖得率最高，提取过程达到平衡时间最短，其原因是纤维素酶有其最佳酶解温度，低于或者超过该温度时活性均会受到限制，导致其得率下降，达到提取平衡时间延长；但在各提取温度下，加入纤维素酶后多糖得率均高于未加入纤维素酶，表明纤维素酶有助于提高其得率。提取过程动力学方程（X为提取时间，Y为多糖得率）及动力学参数见表4。

图7 不同温度下多糖得率与提取时间的关系Fig.7 Relationships between polysaccharides yield and extraction time under different temperatures

表4 提取过程动力学方程及动力学参数Tab.4 Kinetic equations and kinetic parameters for extraction process

由此可知，在不同提取温度下无论是否加入纤维素酶，决定系数R2均不小于0.901 3，表明方程拟合情况良好，提取过程符合一级传质动力学模型；加入纤维素酶后，在提取温度305～335 K 范围内提取速率常数（k）先升后降，在320 K 达到最大值，证实将其作为最佳酶解温度时既可保证较好的提取效果，又能达到节约资源的目的；相同提取温度下加入纤维素酶后的k值均大于未加入纤维素酶，表面扩散系数（DS）亦然。

2.6 提取过程热力学分析 当提取过程达到动态平衡时，可通过Van’t Hoff 方程计算热力学参数ΔH、ΔS、ΔG［16-17］，计算公式为ln（C／C∞-C）＝-ΔG／RT＝-ΔH／RT+ΔS／R［ΔG为提取过程的自由能，单位kJ／mol；ΔS为提取过程的熵，单位J／（mol·K）；ΔH为提取过程的焓，单位kJ／mol；R为摩尔气体常数，数值8.314 J／（mol·K）；T为提取温度，单位K］。

加入纤维素酶后，在提取温度320 K 时多糖提取达到平衡，即C＝C∞，将ln ［C／（C∞-C）］对1／T作线性拟合，可得2 组线性方程，即ln ［C／（C∞-C）］＝-7.841 3X+0.029 8（R2＝0.988 1）、ln ［C／（C∞-C）］＝15.468 8X-0.042 3（R2＝0.987 3），由此计算ΔH、ΔS、ΔG。由于提取温度320 K 时ln ［C／（C∞-C）］无意义，故只计算305、310、315、325、330、335 K 下热力学参数，结果见表5。

表5 不同提取温度下热力学参数Tab.5 Thermodynamic parameters under different extraction temperatures

由此可知，提取温度为305～315 K 时，ΔH、ΔS均大于0，表明提取过程中吸热熵增加［17］；为325～335 K 时，ΔH、ΔS均小于0，表明提取过程中放热熵减小；不同提取温度下ΔG均小于0，表明提取过程为自发过程，其中在320 K 前ΔG值减小，表明提取过程容易进行［17］，而超过320 K 后ΔG值反而增大，表明提取过程不容易进行，从而印证了最佳提取温度确定为320 K（47 ℃）的合理性。

3 讨论

水酶法是在机械破碎的基础上，利用酶（蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等）破坏细胞壁结构，提高植物细胞膜、细胞壁通透性，加快内容物溶解，从而增加提取效率、产物得率。文献报道，采用该方法提取油橄榄叶［18］、菊苣根［19］、半边莲［20］等药材中的多糖时得率高，安全可控。本实验通过纤维素酶法辅助提取藕节多糖，并结合工业生产可行性和成本应用Box-Behnken 响应面法对提取工艺进行优化，发现所建立的模型稳定可靠。

目前，已有关于天然产物提取过程中动力学、热力学的研究［10，16-17］，天然活性成分从实验材料中的溶出过程比较复杂，会受到有效成分分子量大小、药材粉末颗粒形态、药材质地、细胞破碎程度等诸多因素的影响［10］，但有效成分向外扩散过程是关键。因此，本实验采用Fick 扩散公式、Van’t Hoff 方程分析有效成分向外扩散过程的动力学、热力学，发现纤维素酶能提高藕节多糖提取过程中提取速率常数（k）、表面扩散系数（DS），从而加快溶出速率。另外，纤维素酶法提取天然活性成分时，应在其最适温度下进行，这样才能充分发挥生物酶的高效性。