载脂蛋白E在脓毒症中抗炎作用的体内外实验观察

赵田，邵义明

1广东医科大学，广东湛江524001；2广东医科大学附属第二医院；3湛江市器官功能损伤与保护转化医学重点实验室

脓毒症是机体对感染反应失调而导致的器官功能障碍[1]，病死率可达25%，合并休克的脓毒症患者病死率超过80%[2，3]。有效遏制脓毒症的发生发展有助于降低病死率。载脂蛋白E(ApoE)是乳糜蛋白、极低密度脂蛋白(VLDL)、中间密度脂蛋白(IDL)和高密度脂蛋白(HDL)等血浆脂蛋白的主要结构成分，在这些脂蛋白的代谢中起着重要作用[4]。ApoE与许多炎症有关疾病密切相关，如2型糖尿病[5]、心血管疾病[6]、阿尔茨海默病[7]等。目前对于ApoE与脓毒症的文献报道很少。2018年3月～2019年7月，本研究构建了细胞脓毒症模型和动物脓毒症模型，观察ApoE对脓毒症细胞及小鼠的抗炎作用，为脓毒症的治疗提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物、细胞与其他材料 SPF级健康的野生型小鼠(WT，8～12周，雄性)和ApoE敲除小鼠(ApoE-/-，8～12周，雄性)各14只，体质量20～25 g。小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7在37 ℃恒温培养箱生存，在添加10%胎牛血清和青霉素-链霉素的DMEM培养基中进行培养，每2 d传代1次。LPS购自美国Sigma公司。ApoE购自美国Peprotech公司。

1.2 ApoE对脓毒症的体外抗炎作用观察

1.2.1 细胞分组与模型制作 将RAW264.7细胞分为对照组、ApoE组、LPS组、LPS+ApoE组。对照组不做特殊处理。ApoE组加入5 μg/mL的ApoE。LPS组加入1 μg/mL的LPS。LPS+ApoE组先加入1 μg/mL的LPS，6 h后加入5 μg/mL的ApoE。

1.2.2 培养液上清炎症因子检测 各组处理24 h后吸取细胞培养液上清，采用ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-1β。所有检测均需重复3次，取平均值。

1.3 ApoE对脓毒症的体内抗炎作用观察

1.3.1 小鼠分组与模型制作 将WT小鼠分为WT组、WT+LPS组，将ApoE-/-小鼠分为ApoE-/-组、ApoE-/-+LPS组，每组各7只。WT组、ApoE-/-组不做特殊处理。WT+LPS组、ApoE-/-+LPS组采用腹腔注射10 mg/kg LPS制作脓毒症模型。

1.3.2 血清炎症因子检测 造模后1 h通过眼球取静脉血，3 000 r/min离心10 min，获取血清，采用ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-1β。

1.3.3 生存情况观察 造模后72 h观察各组小鼠生存情况。

2 结果

2.1 各组细胞培养液上清炎症因子水平比较 见表1。

表1 各组细胞培养液上清炎症因子水平比较

注：与对照组相比，*P<0.05；与LPS组相比，#P<0.05。

2.2 各组小鼠血清炎症因子水平比较 见表2。

表2 各组小鼠血清炎症因子水平比较

注：与WT组相比，*P<0.01；与ApoE-/-组相比，#P<0.01；与WT+LPS组相比，△P<0.05。

2.3 各组小鼠生存情况比较 ApoE-/-+LPS组小鼠造模后24 h内全部死亡，WT+LPS组小鼠造模后72 h仍有2只存活(Log-Rank=0.002，P=0.96)。

3 讨论

脓毒症是细菌入血后，短时间内释放大量LPS导致机体产生大量炎症介质，这些炎症介质直接作用于机体，使机体产生炎症反应，炎症反应过于强烈会导致严重的心血管系统、肾脏、肝脏等多种器官功能障碍，严重者可导致死亡[8，9]。对脓毒症患者早期实行干预能进一步阻断病情发展，改善患者预后。近年研究表明，ApoE不仅能结合和运输血脂到机体各组织进行代谢[10]，还具有抗炎活性和免疫调节功能。ApoE可调节巨噬细胞吞噬功能，抑制T细胞增殖[11]，促进CD1分子向自然杀伤T(NKT)细胞呈递脂质抗原，同时在细胞水平上提出了ApoE介导的NKT细胞活化模型，可以促使NKT细胞活化[12，13]。

为进一步了解ApoE与脓毒症的关系，我们分别在RAW264.7细胞和小鼠水平上进行脓毒症造模，观察ApoE对炎症因子表达的影响，同时观察注射ApoE后小鼠72 h生存状态。本研究结果显示，LPS组TNF-α、IL-6、IL-1β水平高于对照组，LPS+ApoE组IL-6水平低于LPS组，提示ApoE可以抑制炎症因子表达。也有体外培养实验发现，LPS可通过激活Toll样受体，促进巨噬细胞分泌炎症因子，炎症因子又可以通过激活细胞内MAPK和PI3K/AKT等信号通路抑制ApoE的合成[14]。动物水平实验结果显示，WT+LPS组血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平高于WT组;ApoE-/-+LPS组血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平高于ApoE-/-组；ApoE-/-+LPS组血清IL-6水平高于WT+LPS组；ApoE-/-+LPS组小鼠造模后24 h内全部死亡，WT+LPS组小鼠造模后72 h仍有2只存活。这进一步表明ApoE在脓毒症中起到了抗炎作用。先前研究表明，与野生型小鼠相比，ApoE敲除小鼠血清TNF-α表达水平升高，并且对内毒素和念珠菌感染敏感性增加[15]，小鼠死亡率增加，与我们的实验结果一致。上述研究结果都表明ApoE在脓毒症中发挥抗炎作用。

研究表明，ApoE还可通过增加单核细胞和巨噬细胞中miRNA-146a表达，抑制NB-κB介导的炎症和动脉粥样硬化[16]。我们推测ApoE在脓毒症中的抗炎作用可能也与增加单核细胞、巨噬细胞miRNA-146a水平、抑制NB-κB介导的炎症反应有关。同时，ApoE是一个多态性蛋白，有3种亚型，即ApoE2、ApoE3和ApoE4[17]。在神经相关性疾病中，ApoE3主要发挥保护作用[18]，ApoE4则是危险因子[19，20]。推测ApoE发挥保护作用可能与ApoE3的功能有关，具体机制有待进一步研究。