山慈菇提取物对肝癌细胞增殖及TNF-α、IL-1β、IL-6表达的影响

唐纯明，何自力，李军

湖南师范大学第一附属医院 湖南省人民医院，长沙431000

肝癌具有生长迅速、侵袭转移能力强、恶性度高、预后差等特点[1]，寻找治疗肝癌的有效药物迫在眉睫。山慈菇为常用抗肿瘤中药之一，是兰科植物中的干燥假鳞茎聚生，具有燥湿化痰、消肿和软坚散结等作用[2～4]。近年来多项研究显示，山慈菇有广泛的抗肿瘤、抗炎、抑制血管生成以及抑制瘢痕增生等作用，但其抗肝肿瘤作用机制尚未完全阐明[3]。炎症因子TNF、IL-1β、IL-6、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶2(COX-2)可调节细胞周期、增殖和凋亡，参与肿瘤的发病[5～7]。IL-1β和IL-6在正常情况下表达水平较低，肿瘤状态下可诱导其高表达[8,9]。2017年6月～2019年3月，本研究观察了山慈菇提取物对肝癌SMMC-7721细胞增殖及TNF-α、IL-1β、IL-6表达的影响，从炎症反应角度探讨山慈菇提取物的抗肿瘤机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要实验材料 人肝癌SMMC-7721细胞购自中国科学院细胞库，编号TCHu52。山慈菇购于北京同仁堂药店。山慈菇提取物的配制参照文献[10]，将山慈菇水煎剂配制成1.5 g/mL的储备液，分装后于4 ℃储存待用。FBS和DMEM培养基购于美国Gibco公司。PBS、CCK-8试剂盒、青霉素-链霉素混合液、胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)、结晶紫染色液、TRIzol试剂购自北京索莱宝科技有限公司。逆转录试剂盒和qRT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。实验所需引物由广州艾基生物技术有限公司合成。TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒购自Elascience公司。CO2培养箱、MB-530酶标仪购自BIOBASE公司。奥林巴斯倒置显微镜购自上海普赫光电公司。Nanodrop2000型超微量分光光度计购自美国Thermo公司。Mx3000P型荧光定量PCR仪购自美国Agilent公司。

1.2 细胞增殖能力检测 SMMC-7721细胞置于37 ℃、5%CO2条件培养箱中，在含10% FBS和双抗的DMEM培养基中培养。取对数生长期的SMMC-7721细胞，在96孔板中分别加入含0、100、200、400、600、800、1 000 mg/L山慈菇提取物的完全培养液100 μL，分别于培养24、48、72 h后加入CCK-8试剂测算细胞增殖能力。0、100、200 mg/L的药物作用24、48、72 h细胞增殖抑制率差异均无统计学意义。400、600、800、1 000 mg/L的药物作用24、48、72 h细胞增殖抑制率高于0 mg/L者，600、800、1 000 mg/L的药物作用24、48、72 h细胞增殖抑制率高于400 mg/L者(P均<0.05)。见表1。选取质量浓度为400、600、800 mg/L的山慈菇提取物进行后续实验。

表1 不同浓度山慈菇提取物对SMMC-7721细胞增殖的影响

注：与同时点0 mg/L组相比，*P<0.05；与同时点400 mg/L组相比，#P<0.05。

1.3 细胞克隆形成能力观察 取对数生长期SMMC-7721细胞，以5×102/孔接种于6孔板中，分为0 mg/L组、400 mg/L组、600 mg/L组、800 mg/L组，分别加入0、400、600、800 mg/L的山慈菇提取物处理24 h，更换常规培养基，继续培养14 d。用PBS洗涤6孔板中细胞2次，100%的甲醇固定15 min，0.1%结晶紫液染色15 min，PBS洗去染色液，拍照，观察克隆形成情况，计算克隆形成率。

1.4 细胞形态观察 取对数生长期SMMC-7721细胞接种于6孔板中，置于培养箱中培养后，按“1.3”方法分组并处理。培养24 h后，光学倒置显微镜观察细胞形态变化并拍照。

1.5 细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA检测 将SMMC-7721细胞接种于6孔板中，待培养后，按“1.3”方法分组并处理，收集细胞，用TRIzol法收集细胞总RNA，并测定浓度。TNF-α mRNA上游引物序列为5′-GCTGCACTTTGGAGTGATCG-3′、下游引物序列为5′-GAGGGTTTGCTACAACATGGG-3′，长度140 bp；IL-1β mRNA上游引物序列为5′-AGAAGTACCTGAGCTCGCCA-3′、下游引物序列为5′-CTGGAAGGAGCACTTCATCTGT-3′，长度106 bp；IL-6 mRNA上游引物序列为5′-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3′、下游引物序列为5′-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3′，长度149 bp；内参GAPDH上游引物序列为5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′、下游引物序列为5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，长度258 bp。严格按照试剂盒说明进行逆转录和qRT-PCR反应。以2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量。

1.6 细胞培养液上清中IL-1β、IL-6、TNF-α检测 对数生长期SMMC-7721细胞接种于6孔板中，置于培养箱中培养，按“1.3”方法分组并处理，24 h后收集各组细胞培养液上清，采用ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

2 结果

2.1 各组SMMC-7721细胞克隆形成能力比较 0、400、600、800 mg/L组克隆形成率分别为100%、76.12%±8.12%、43.43%±6.54%、27.69%±3.38%。400、600、800 mg/L组细胞克隆形成率低于0 mg/L组，600、800 mg/L组克隆形成率低于400 mg/L组(P均<0.05)。

2.2 各组SMMC-7721细胞形态变化 0 mg/L组细胞排列紧密，呈梭形，形态饱满，边界清楚；而400、600、800 mg/L组随着药物浓度增大，细胞形态皱缩，贴壁差，细胞易脱落，尤以800 mg/L组最明显。见图1。

注：A、B、C、D分别为0、400、600、800 mg/L组。

图1 山慈菇提取物对SMMC-7721细胞形态的影响

2.3 各组SMMC-7721细胞TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达比较 400、600、800 mg/L组细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达低于0 mg/L组，600、800 mg/L组TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达低于400 mg/L组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组SMMC-7721细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达比较

注：与0 mg/L组相比，*P<0.05；与400 mg/L组相比，#P<0.05。

2.4 各组SMMC-7721细胞培养液上清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较 400、600、800 mg/L组细胞培养液上清TNF-α、IL-1β、IL-6水平低于0 mg/L组，600、800 mg/L组TNF-α、IL-1β、IL-6水平低于400 mg/L组(P均<0.05)。见表3。

表3 各组SMMC-7721细胞培养液上清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

注：与0 mg/L组相比，*P<0.05；与400 mg/L组相比，#P<0.05。

3 讨论

山慈菇味辛苦，性微寒，普遍存在于自然界中。其获取较容易，毒性小，常用于治疗炎性水肿、燥热型矽肺和急性痛风性关节炎，还具有抑制瘢痕增殖、防止组织粘连形成、提高机体免疫力和护肝等多种作用[2,11]。山慈菇对多种肿瘤如乳腺癌、甲状腺癌、食管癌、胃癌和大肠癌等具有抑制作用[2,10,12,13]。关于山慈菇提取物抗肝癌细胞就增殖的作用及其具体机制尚未充分阐明。本研究以山慈菇提取物作用于肝癌SMMC-7721细胞，发现其能有效抑制SMMC-7721细胞的增殖活性，并且呈一定的时间和浓度依赖性。平板克隆形成实验显示，SMMC-7721细胞在不同浓度山慈菇提取物作用下，细胞克隆形成能力明显降低。而且，SMMC-7721细胞在不同浓度山慈菇提取物作用后，细胞形态发生了显著变化，包括细胞变圆、皱缩，贴壁能力差，细胞易脱落，而且药物浓度越高，细胞脱落越明显。这进一步说明山慈菇提取物具有抑制SMMC-7721细胞增殖的作用。

TNF-α是炎症反应的启动因子，生理状态下有助于增强免疫力和抑制肿瘤生长，但当超过一定量时可增大和加重炎症反应，引起多种病理损伤，促进肿瘤增殖[6]。研究表明，TNF-α参与人乳头瘤病毒感染后的机体免疫防御，TNF-α高表达可能与宫颈癌的发生发展和肿瘤细胞增殖有关[14]。李京涛等[15]观察了益脾养肝方对肝癌前病变大鼠血清TNF-α和IL-6水平的影响，发现该药可抑制肝癌癌前病变大鼠病情进展，可能是通过降低TNF-α和IL-6的表达水平来实现的。还有研究发现，肝癌化疗后患者血清中TNF-α、IL-6水平低于确诊未治的肝癌患者[16]。本研究结果显示，经山慈菇提取物作用后，SMMC-7721细胞中TNF-α mRNA表达下调，细胞分泌TNF-α减少，提示山慈菇提取物可能抑制了TNF-α的表达与分泌。

肿瘤微环境主要是由肿瘤细胞、免疫细胞、细胞因子、炎症因子等相互作用而形成的，受多阶段、多因素调控[17]。IL-1家族中，IL-1β与肿瘤发生发展关系最为密切，是机体调控炎症反应与免疫应答的重要因子[18]。近年来多项研究发现，IL-1β作为肿瘤免疫重要因子之一，其在肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤中高水平表达[19,20]。IL-1β可能通过启动肿瘤增殖和抗凋亡等途径参与多种恶性肿瘤的疾病进程。IL-6也是一种促炎细胞因子，是连接肿瘤与炎症的关键炎症因子[21,22]。在致癌物诱导的小鼠肝癌模型中，血清IL-6水平升高，而薏苡仁提取物能明显降低血清IL-6水平，并且能有效抑制成瘤率。也有研究发现，辣椒碱对SMMC-7721细胞增殖具有明显抑制作用，有可能与其抑制细胞中IL-6的表达与分泌有关[23]。本研究结果显示，经山慈菇提取物作用后，SMMC-7721细胞中IL-1β、IL-6 mRNA表达和IL-1β、IL-6分泌水平均明显降低，提示山慈菇提取物的增殖抑制作用可能与抑制IL-1β、IL-6的表达和分泌有关。

综上所述，山慈菇提取物对SMMC-7721细胞增殖具有显著抑制作用，还可抑制细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达与分泌。山慈菇提取物可能通过抑制炎症因子分泌，调节肿瘤微环境，从而起到抑制肿瘤细胞增殖的作用。通过山慈菇提取物干预TNF-α、IL-1β、IL-6的表达与分泌有望成为肝癌等肿瘤疾病治疗的新策略。关于山慈菇提取物对肿瘤细胞增殖及炎症因子表达抑制作用所涉及的具体信号通路，还有待进一步探索。