12C6+离子束诱变选育温度耐受螺旋藻高产藻株及其培养条件的优化

王丽娟 郑天翔 杨宋琪 李 欣 罗光宏

1（河西学院甘肃省微藻技术创新中心 张掖734000）

2（河西学院农业与生态工程学院 张掖734000）

3（甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室 张掖734000）

4（中国科学院近代物理研究所 兰州730000）

螺旋藻（Spirulina sp.）是一种原核生物，属于蓝藻门（Cyanophyta）蓝藻纲（Cyanobacteria）颤藻科（Oscillatoriaceae）螺旋藻属（Spirulina）。由于含有丰富的蛋白质和一些高附加值产物，而具有较高的经济价值［1］。目前，螺旋藻的应用已从保健食品扩大到食品添加剂、医药、饲料和化妆品等领域。随着应用领域的逐渐扩大，筛选高产优质的螺旋藻品系越来越受到关注。但其产量和质量不仅受培养条件的影响，还受地区和环境因素的制约。现有的螺旋藻品系一个是非洲Chad湖钝顶螺旋藻（Spirulina platensis），另一个是美洲墨西哥Sosa Texcoco 湖极大螺旋藻（Spirulina mxamia）。这两个藻种属于耐高温品系，对温度的耐受性与原产地的温度接近，这也是我国螺旋藻养殖区域主要分布在南方沿海地区的主要原因。而甘肃张掖位于我国西北部河西走廊中段，属于大陆性气候，气温年变化较大，冬冷夏热，螺旋藻的养殖期普遍较短，容易造成设备浪费。因此，为了提高生产周期和产量，探索适合本地区温度生长繁殖的藻株有重要意义。目前，国内外学者采用驯化、自然选择、物理诱变、化学诱变和太空诱变育种方式选育出了许多新的螺旋藻藻株［2-7］，但采用碳离子辐照诱变螺旋藻的研究尚未见相关报道。

碳离子诱变育种与传统的辐射法及化学诱变法相比，具有损伤轻、突变率高、突变谱广、遗传相对稳定等特点，已经在微生物以及植物诱变育种中取得了巨大的经济效益与社会效益［8-10］。近几年，在微藻诱变育种中的应用也越来越多，如王芝瑶等［11］利用12C6+离子束对微拟球藻进行诱变育种，获得了两株高生长速率和高油脂产率的突变株。李悦明等［12］对微拟球藻进行了12C6+离子束辐照联合三氯生诱变选育，获得了一种具有较高二十碳五烯酸产量的微拟球藻突变株。王洁［13］研究了12C6+离子束对四尾栅藻光合系统的影响以及诱变机理，并筛选得到了光合能力较弱和耐高光的四尾栅藻藻株。

本研究利用12C6+离子束对螺旋藻进行诱变处理，确定致死率；采用平板分离和温度选育对大量突变株进行初筛，结合生物量和遗传稳定性等因素筛选温度耐受突变株，并对其培养条件进行优化，旨在探索螺旋藻优良藻种选育的新途径，并为其进一步工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 藻种及培养基

极大螺旋藻（Spirulina maxima）由甘肃省微藻技术创新中心提供。培养基为Zarrouk 培养基。配方如下：NaHCO316.80 g/L、NaCl 1.00 g/L、NaNO32.50 g/L、K2SO41.00 g/L、K2HPO40.50 g/L、MgSO4·7H2O 0.20 g/L、CaCl2·2H2O 0.04 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、乙二胺四乙酸0.08 g/L、A51.00 g/L、B61.00 g/L，调整pH 为9.0。固体培养基加入2%琼脂。培养温度30 ℃，光暗比12∶12 h，光照强度60 μmol/(m2·s)。（注： A5， H3BO32.86 g/L、MnCl2·4H2O 1.80 g/L、 ZnSO4·7H2O 0.22 g/L、MoO30.01 g/L、CuSO4·5H2O 0.08 g/L；B6，NH4VO322.90 mg/L、 NiSO3·7H2O 47.80 mg/L、 NaWO417.90 mg/L、Ti(SO4)240.00 mg/L、Co(NO3)2·6H2O 4.40 mg/L）。

1.2 方法

1.2.112C16+离子束辐照诱变

取对数生长期的螺旋藻藻液1.5 mL，藻细胞初始OD560值（溶液在560 nm波长处的吸光值）为0.10，置于无菌平皿中，利用中国科学院现代物理研究所兰州重离子加速器国家重点实验室提供的12C6+离子束对螺旋藻进行辐照处理，剂量率为80 Gy/min，剂量为0 Gy、200 Gy、400 Gy、600 Gy、800 Gy、1 000 Gy。其中0 Gy为对照组。

1.2.2 致死率的测定

将对照组与不同剂量辐照后的藻液梯度稀释，吸取0.2 mL 藻液均匀涂布于螺旋藻固体平板培养基上，用封口膜封好，倒置培养，每组做3 个重复。在30 ℃下培养21 d，用公式（1）［14］计算致死率（%）。

1.2.3 温度耐受突变株的筛选

将辐照后的藻液梯度稀释，并在无菌条件下吸取辐照后的藻液0.1 mL 均匀涂布于螺旋藻固体平板培养基上，分别置于10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃培养，光照强度为60 μmol/(m2·s)，光暗比为12∶12 h。对不同温度培养下生长迅速的螺旋藻藻株进行取样，置于96 孔板中进行单株培养。并用酶标仪测定其OD560值。当藻液OD560≥0.60时，采用体视镜单管移液器挑选分离方法，从螺旋藻培养液中吸取少量带有藻丝体的藻液进行稀释，取稀释后的藻液置于单凹片上，在低倍镜下观察藻丝体，同时选取单株目标藻丝体进行培养。重复上述单株分离选育步骤，直至每一株系形态稳定。最后培养10 d 后测定生物量，对生物量提高10%的突变株进行传代培养。

1.2.4 温度耐受突变株的稳定性测定

将筛选得到的螺旋藻突变株连续传代培养10次，测定其生物量，以检测突变株的遗传稳定性。

1.2.5 突变株培养条件的优化

将培养至对数期的温度耐受突变株接种至Zarrouk 培养基中，并在光照培养箱中培养18 d，藻细胞初始接种浓度OD560为0.20±0.02。在最佳耐受温度下（Sm04#和Sm21#培养温度分别为20 ℃和35 ℃），采用单变量原则分别考察不同pH（7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）、不 同 光 照 强 度（40 μmol/(m2·s)、50 μmol/(m2·s)、60 μmol/(m2·s)、70 μmol/(m2·s)、80 μmol/(m2·s)、90 μmol/(m2·s)、100 μmol/(m2·s)）和 不 同 光 暗 比（8∶16 h、10∶14 h、12∶12 h、14∶10 h、16∶8 h）对生物量的影响。

1.2.6 测定方法

生物量的测定：取一定体积藻液，用混合纤维滤膜（0.45 μm）真空抽滤，于105 ℃烘箱中烘至恒重，见公式（2）。

式中：WD表示单位体积藻体的干重（g/L）；W1为混合纤维滤膜烘至恒重后的质量（g）；W2为滤膜和藻样烘至恒重后的总质量（g）；V 为藻液体积（L）。

可溶性糖的测定：取20 mL藻液离心，藻泥加入5 mL磷酸盐缓冲液（pH=7.8），混匀后低温超声20 min，并于-80 ℃冻融循环3 次，离心后上清液用于测定螺旋藻可溶性糖，可溶性糖的测定采用硫酸蒽酮法。

蛋白质的测定：采用凯氏定氮法。

2 结果与分析

2.1 12C16+离子束辐照诱变致死率

辐照诱变螺旋藻致死率结果见图1。由图1 可知，在200 Gy、400 Gy、600 Gy、800 Gy、1 000 Gy时，致死率分别为38.32%、51.21%、71.84%、78.47%和94.58%。随着吸收剂量的增加，致死率增大。根据诱变经验，致死率为70%～80%时，会产生较高的阳性突变率［15-16］。因此，本研究将剂量在600 Gy 和800 Gy 辐照下的藻株作为重点筛选对象。

2.2 温度耐受突变株的筛选

对600 Gy 和800 Gy 辐照下的螺旋藻藻株通过不同温度培养后初步筛选得到156株生长迅速的突变株，进一步从这156株中筛选出2株生物量最高且遗传稳定的耐低温和耐高温的突变株。分别是经600 Gy 辐照后20 ℃和800 Gy 辐照后35 ℃培养条件下的螺旋藻突变株Sm04#和Sm21#。对筛选得到的2株温度耐受突变株进行生长曲线测定，结果见图2。培养末期突变株Sm04#和Sm21#的生物量达到0.54 g/L 和0.91 g/L，较各自对照组分别提高了11.49%和12.64%，说明Sm04#和Sm21#是2 株优势明显的耐低温和耐高温突变株。

2.3 不同pH对螺旋藻突变株生长的影响

在pH 分别为7.0、8.0、8.5、9.0、9.5 和10.0条件下对突变株Sm04#和Sm21#进行培养，培养温度分别为20 ℃和35 ℃，光照强度60 μmol/(m2·s)，光暗比12∶12 h。每隔1 d 用酶标仪测定藻液OD560，结果如图3所示。由图3可知，两株突变株的最适pH均为9.0，pH为9.5次之，中性环境生长最慢。

2.4 不同光照强度对螺旋藻突变株生长的影响

在 光 照 强 度 值 分 别 为40 μ mol/(m2·s)、50 μmol/(m2·s)、60 μmol/(m2·s)、70 μmol/(m2·s)、80 μmol/(m2·s)、90 μmol/(m2·s)和100 μmol/(m2·s)条件下对突变株Sm04#和Sm21#进行培养，培养温度分别为20 ℃和35 ℃，pH=9.0，光暗比12∶12 h，培养18 d 后测定藻液OD560，结果见图4。由图4 可知，Sm04#和Sm21#的最适光强分别为70 μmol/(m2·s)和80 μmol/(m2·s)。

2.5 不同光暗比对螺旋藻突变株生长的影响

在光暗比分别为8∶16 h、10∶14 h、12∶12 h、14∶10 h 和16∶8 h 条 件 下 对 突 变 株Sm04#和Sm21#进行培养，培养温度分别为20 ℃和35 ℃，光照强度分别为70 μmol/(m2·s)和80 μmol/(m2·s)，pH=9.0，培养18 d 后测定藻液OD560，结果见图5。由图5可知，Sm04#和Sm21#的最适光暗周期分别为12∶12 h和14∶10 h。

2.6 突变株中蛋白质和多糖含量特性

分别将螺旋藻突变株Sm04#和Sm21#在各自适宜的条件下进行扩大培养，并测定其蛋白质和可溶性糖含量，结果见表1。由表1 可知，在相同培养条件下，突变株Sm04#和Sm21#蛋白质的含量分别为70.97%和69.31%，相比各自的对照组分别增加了5.06%和2.22%，而可溶性糖含量Sm04#和Sm21#相比于对照分别增加了5.77%和2.11%。

表1 突变株Sm04#和Sm21#中蛋白质和多糖含量Table 1 Contents of protein and polysaccharide in the mutant strains Sm04#and Sm21#

3 讨论与结论

重离子束对生物体的诱变效应是将动量传递、能量和质量沉积、电荷中和与交换融合在一起［17］，经重离子辐照的细胞会生成活性氧簇（ROS），一般包括·O2-、·OH 和H2O2等。ROS 会通过细胞氧化应激反应导致DNA 单双键断裂、蛋白质变性、失活等，诱导细胞凋亡，甚至导致其坏死。正常情况下，植物细胞内活性氧的产生和清除处于动态平衡状态，ROS 浓度很低，不会引起伤害。但当植物处于重离子辐照等逆境条件时，这种平衡会遭到破坏［18］。结果ROS 的浓度超过了伤害“阈值”，导致蛋白质、核酸、酶结构的氧化破坏，最后导致植物受伤害甚至死亡。本实验中，细胞膜是藻体最先接触辐照的部位，过多的活性氧会引起膜脂过氧化，而丙二醛（MDA）是细胞膜脂质过氧化分解的最终产物，是膜脂伤害程度的标志。超氧化物歧化酶（SOD）能清除·O2-，可在一定范围内通过其调节使细胞免受毒害。王洁等［19］研究了重离子辐照对四尾栅藻MDA 和SOD 的影响，结果发现，低剂量辐照时，MDA和SOD显著上升后可恢复至正常水平；高剂量辐照时，MDA 和SOD 短期内下降且不能恢复正常。说明重离子辐照对藻体有一定毒性，且有一定剂量效应。在低剂量时，藻细胞能通过自我调节机制来增强抗氧化酶活性以增强其抗氧化和抵抗逆境的能力，从而减轻损伤，保证生理代谢的正常进行。在较高剂量时，细胞维持较高的·O2-，胞内的活性物质包括酶会受到损伤，超出机体的耐受能力。这与重离子辐照对其他植物的影响结果一致［20-22］。

可溶性糖是反映植物抗逆性的指标，不仅对细胞膜和原生质体有一定的保护作用，还起到保护酶类的作用。植物体经过重离子辐照后在生理上主要表现为可溶性糖含量的增加和生物体内活性氧的增加［23］。本实验中，突变株Sm04#和Sm21#可溶性糖含量都有所积累，并且Sm04#含量高于Sm21#。这可能是因为低剂量的辐照使藻株的染色体和细胞膜遭到破坏，促使细胞自身修复系统启动，可溶性糖积累，增强了抵抗逆境的能力，从而维持机体的正常生理活动。而吸收剂量较高时，藻株的内囊体膜受到严重损害，细胞所需的能量和有机物严重供给不足，从而影响了多糖的含量。这与王静等［24］研究UV-B 对紫球藻的影响结果一致，即低剂量促进，高剂量抑制。重离子辐照对其他植物的影响也有相似性，但不同植物的影响趋势不尽相同［25-26］，可能与品种间的辐射敏感差异性有关。蛋白质是植物细胞内的生命物质，在细胞生命活动中起非常重要的作用，并且蛋白质是亲水性胶体，对膜的保护性大于可溶性糖。本实验中，突变株Sm04#蛋白质含量高于Sm21#。这可能是因为在600 Gy 时，藻细胞自我调节以抵抗逆境，激活了相关蛋白合成基因，合成大量的相关抗逆蛋白和酶，使蛋白质含量增加，以适应外界环境的变化［22］。而吸收剂量增大时，推测可能是由于光合作用场所内囊体逐渐溶解和消失，蓝藻细胞色素的光能捕获和传递能力降低，蛋白电子产率及传递速率也随之降低，蛋白质含量下降［27］。600 Gy 辐照处理后的可溶性糖和蛋白质均有显著增加，说明600 Gy 辐照处理能增加藻株的抗逆性。这对螺旋藻抗逆性的提高和新品种的选育具有重要意义。但藻株辐照后测定的生理生化指标偏少，尤其在0～600 Gy 间的变化趋势不够详尽，因此，重离子辐照对螺旋藻的抗逆性增强和新品种选育中的作用机理还有待进一步研究。

通过12C6+离子束对螺旋藻进行辐照，结合平板分离和温度选育筛选出2 株温度耐受株Sm04#和Sm21#，生物量达到0.54 g/L 和0.91 g/L，较对照组分别提高了11.49%和12.64%，并优化了其培养条件。结果说明，对采用重离子束辐照联合温度选育的方法，可以获得温度耐受高产螺旋藻突变

株，但是否产业化优势明显尚有待于室外大规模培养验证。