基于肠道上皮细胞相关转运子探讨四妙散对高尿酸血症小鼠的祛湿机制

张志明 高碧珍 齐张旸 吴宽裕 赵钟文 黄青青 陈世涵

【摘 要】目的：探究四妙散对高尿酸血症小鼠回肠组织三磷酸腺苷结合盒转运蛋白转运体G2（ABCG2）、葡萄糖转运蛋白9（GLUT9）表达的影响。方法：将36只小鼠随机分为空白对照组，模型对照组，四妙散低、中、高剂量组，别嘌醇组，每组6只。除空白对照组外，其余各组建立高尿酸血症小鼠模型，四妙散低、中、高剂量组分别给予低剂量（0.175 g·mL-1）、中剂量（0.35 g·mL-1）、高剂量（0.7 g·mL-1）四妙散灌胃，别嘌醇组予别嘌醇（40 mg·kg-1）灌胃。检测各组小鼠血尿酸、回肠ABCG2和GLUT9表达变化，探究四妙散治疗高尿酸血症的可能机制。结果：各模型组小鼠血清尿酸明显高于空白对照组（P < 0.05），不同剂量四妙散及别嘌醇治疗后小鼠血清尿酸水平降低，差异有统计学意义（P < 0.05），回肠ABCG2表达升高，GLUT9表达下降，差异有统计学意义（P < 0.05），其中四妙散中、高剂量组对ABCG2和GLUT9影响最大。结论：四妙散通过调节回肠ABCG2及GLUT9的表达起到降尿酸作用。

【关键词】 高尿酸血症;四妙散;三磷酸腺苷结合盒转运蛋白转运体G2;葡萄糖转运蛋白9

【ABSTRACT】Objective：To investigate the effect of Simiao San（四妙散）on the expressions of ABCG2 and GLUT9 in the ileum of mice with hyperuricemia.Methods：Thirty-six mice were randomly divided into a blank control group，a model control group，Simiao San low，medium and high dose groups，and an allopurinol group，6 mice in each group.In addition to the blank control group，hyperuricemia mice models were established in the other groups.The Simiaosan low，medium and high dose groups were correspondingly given intragastric administration of low dose（0.175·g·mL-1），medium dose（0.35 g·mL-1），and high dose（0.7 g·mL-1）of Simiao San，so did the allopurinol group with allopurinol（40 mg·kg-1）.The expressions of serum uric acid，ABCG2 and GLUT9 in ileum were detected to explore the possible mechanism of Simiao San in the treatment of hyperuricemia.Results：The level of serum uric acid in mice of each model group was significantly higher than that in the blank control group（P < 0.05）.The serum uric acid level of mice treated with different doses of Simiao San and allopurinol decreased with statistical significance（P < 0.05）.The expression of ABCG2 in ileum increased and the expression of GLUT9 decreased with statistical significance（P < 0.05）.The Simiao San middle and high doses had the greatest impact on ABCG2 and GLUT9.Conclusion：Simiao San can reduce uric acid by regulating the expression of ABCG2 and GLUT9 in ileum.

【Keywords】 hyperuricemia;Simiao San（四妙散）;ABCG2;GLUT9

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄障碍引起的以高水平血尿酸为特征的慢性代谢性疾病。黄嘌呤氧化酶（XOD）是尿酸形成过程中的一种关键酶，XOD抑制剂类药物别嘌醇存在严重的过敏反应或者肝肾病变的风险，并且治疗费用昂贵[1-2]。因此，研究不良反应小的新型降血尿酸药物具有重要的临床意义。四妙散是清热祛湿的代表方，记载于《成方便读》，是清·张秉承在《丹溪心法》二妙散基础上加牛膝、薏苡仁组成[3]。四妙散加减方在现有的研究中均展现了很好的降尿酸作用，改善小鼠肾功能，其作用与抑制XOD活性及抗炎症反应作用有关[4-6]。本研究意在探明四妙散对HUA模型小鼠肠道祛湿机制，为临床治疗HUA提供理论基础。

1 实验材料

1.1 实验动物 36只4周龄SPF级雄性昆明小鼠（湖南斯莱克景达实验动物有限公司），体质量（20±2）g，动物许可证号SCXK（湘）2016-0002。饲养温度20～22 ℃，湿度50%～70%，自由进食及饮水，光照和黑暗12 h更替。

1.2 实验试剂 别嘌醇片（上海信谊万象药业有限公司，生产批号05170205）;四妙散（福建中医药大学附属第二人民医院中药制剂室提供，药物组成：苍术15 g、牛膝10 g、黄柏15 g、薏苡仁30 g）;腺嘌呤（Sigma，生产批号021M0181V）;兔抗葡萄糖转运蛋白6（GLUT6）/GLUT9多克隆抗体（Bioss，货号bs-13388R）;抗乳腺癌耐药蛋白（BCRP）/三磷酸腺苷结合盒转运蛋白转运体G2（ABCG2）单克隆抗体（Abcam，货号ab207732）;辣根酶标记山羊抗兔免疫球蛋白G（H+L）（中杉金桥，货号ZB-2301）;小鼠尿酸检测试剂盒（上海酶免，貨号MM44292M2）。

1.3 实验器材 紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司，型号UV-1600PC）;蛋白垂直电泳仪（北京市六一仪器厂，型号DYY-6C）;超高灵敏度化学发光成像系统[伯乐生命医学产品（上海）有限公司，型号Chemi DocTM XRS+]。

2 方 法

2.1 慢性HUA小鼠模型建立及给药方法 将36只

小鼠随机分为空白对照组，模型对照组，四妙散低、中、高剂量组，别嘌醇组，每组6只。除空白对照组外，其余各组造模，给予10%酵母膏饲料喂养，并每日给予腺嘌呤（100 mg·kg-1）处理12 d。各治疗组在造模第6天开始给药处理，四妙散各剂量组按照生药量9.1 g·kg-1和体表面积折算成动物的等效剂量，低、中、高剂量组分别为等效剂量的0.5倍（0.175 g·mL-1）、1倍（0.35 g·mL-1）、2倍（0.7 g·mL-1），每只每日按0.26 mL·（10 g）-1灌胃1次，别嘌醇组（40 mg·kg-1）每只每日按照0.2 mL·（10 g）-1灌胃1次，处理7 d后取样检测。

2.2 ELISA检测 采用双抗夹心法检测各组小鼠血清中尿酸的含量，小鼠尿酸与微孔板中包被的尿酸捕获抗体结合，在与HRP标记的抗体结合形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，洗脱后加入TMB显色，TMB在HRP酶催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。实验步骤严格按照试剂盒操作说明书进行，每个样本设置4个复孔，检测450 nm波长处的吸光度（OD值）并取平均值，根据标准品浓度和OD值制作标准曲线，使用标准曲线计算出待测样品中的尿酸含量。

2.3 免疫组化 取小鼠回肠组织进行石蜡包埋制作石蜡切片;石蜡切片经过烤片、脱蜡、水化、抗原修复;然后使用质量分数为3%的过氧化氢孵育10 min以去除内源性过氧化物酶;接着使用质量分数为5%的BSA在37 ℃孵育30 min封闭非特异性结合位点;加入稀释好的一抗进行抗原-抗体反应，4 ℃孵育过夜（一抗稀释比：GLUT9为1∶400，ABCG2为1∶500）;洗去未结合的一抗，加入稀释好的二抗，37 ℃孵育30 min;DAB显色5～10 min，在显微镜下观察染色程度;洗去多余染色液，加入苏木精复染3 min，盐酸酒精分化，返蓝;显微镜下观察，细胞核被染成蓝紫色，目的蛋白呈黄棕色。

2.4 Western Blot检测 取各组加入相应的裂解液中，4 ℃裂解30 min，离心机以10 000 r·min-1离心10 min，离心半径10 cm，小心吸取上清液，即得总蛋白。利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。蛋白变性、上样、电泳1～2 h，湿法转膜30～50 min。4 ℃孵育一抗溶液过夜;室温孵育二抗1～2 h。在膜上滴加ECL曝光液，曝光。用Quantity One软件分析各抗体条带灰度值。

2.5 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），方差齐性用LSD法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组HUA小鼠血尿酸含量比较 ELISA检测结果显示，模型对照组血尿酸含量均 >

200 μmol·L-1，提示造模成功。与空白对照组比较，模型对照组尿酸含量显著增加（P < 0.01）;与模型对照组比较，四妙散低、中、高剂量组和别嘌醇组尿酸含量均显著降低（P < 0.01）;与别嘌醇组比较，不同剂量四妙散组的血尿酸含量无明显变化（P > 0.05）。见表1。

3.2 四妙散对ABCG2、GLUT9表达和分布的影响

3.2.1 各组HUA小鼠回肠组织ABCG2分布比较 免疫组化结果显示，ABCG2主要分布于肠道内侧上皮细胞中。与空白对照组比较，模型对照组上皮细胞中ABCG2的表达明显降低;与模型对照组比较，四妙散低、中、高剂量组和别嘌醇组的ABCG2表达均明显升高，其中四妙散中剂量组和别嘌醇组表达升高最明显。见图1。

3.2.2 各组HUA小鼠回肠组织GLUT9分布比较 免疫组化结果显示，GLUT9主要分布于肠道内侧上皮细胞中。与空白对照组比较，模型对照组上皮细胞中GLUT9表达明显升高;与模型对照组比较，四妙散低、中、高剂量组对GLUT9的表达均有抑制作用，但不是很明显，别嘌醇组GLUT9表达明显降低。见图2。

3.3 各组HUA小鼠回肠组织ABCG2和GLUT9蛋白表达水平比较 Western Blot检测结果显示，模型对照组与空白对照组比较，模型对照组ABCG2表达明显降低，GLUT9表达明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）;与模型对照组比较，四妙散中、高剂量组和别嘌醇组ABCG2蛋白表达明显升高（P < 0.05），但四妙散低剂量组差异无统计学意义（P > 0.05）;四妙散低、中、高剂量组和别嘌醇组对GLUT9的表达均有显著性抑制作用（P < 0.05）。见表2、图3。

4 討 论

四妙散出自清·张秉成所著的《成方便读》，方中黄柏清热燥湿，泻火解毒，入下焦，直清下焦湿热;苍术健脾燥湿、祛风除湿，有利尿作用;薏苡仁清热利湿兼健脾;牛膝祛湿热、补肝肾、强筋骨，同时还可以通血脉而利关节，并引药下行，诸药相伍使得湿热得以泄化，痹证得以清除[3]。HUA是人群中常见的代谢性疾病，研究表明，临床常用的XOD抑制剂别嘌醇存在过敏反应、粒细胞缺乏症、肾脏毒性等不良反应[7]。本研究结果表明，给予不同剂量的四妙散和别嘌醇治疗之后，模型小鼠血尿酸含量恢复正常水平，不同剂量四妙散组和别嘌醇组的血尿酸水平无明显差异，表明四妙散具有和别嘌醇相同的降尿酸作用。

大部分HUA是由尿酸排泄障碍引起的[8]，大多数研究主要集中在肾脏对血尿酸含量的影响，已有研究表明肠道也参与了尿酸排泄，大约有1/3的尿酸通过肠道排泄[9]。本研究表明，模型组小鼠回肠组织ABCG2的表达显著降低

（P < 0.01），而GLUT9的表达显著升高（P < 0.01），提示ABCG2及GLUT9的表达参与了HUA的发展过程。与ELISA检测结果相一致，表明四妙散可以通过上调ABCG2表达促进尿酸排泄，另外通过下调GLUT9表达抑制尿酸重吸收，从而产生降尿酸作用。有研究表明，甲状腺功能亢进容易导致HUA，其机制是甲状腺旁腺激素会抑制肠、肾ABCG2的表达导致尿酸排泄减少[10-11]。DINOUR等[12]研究表明，GLUT9缺陷者尿酸排泄率为健康受试者的1.5倍，表明抑制GLUT9的表达能够抑制尿酸的重吸收，促进尿酸排泄。本研究结果表明，四妙散低、中、高剂量组均能显著促进回肠组织中ABCG2的表达和降低GLUT9的表达影响血尿酸含量，其中四妙散中、高剂量组的影响最明显，四妙散低剂量略低于中、高剂量组，因此，ABCG2和GLUT9可以作为降尿酸药物的靶点，四妙散与别嘌醇具有相同的降高尿酸作用，且四妙散使用药食同源和保健食品目录中药材，长期服用无明显不良反应。

综上所述，四妙散可以明显降低HUA模型小鼠的血尿酸含量，通过调节肠道上皮细胞相关转运子，即上调回肠组织ABCG2的表达和抑制GLUT9的表达，增加尿酸清除达到对高尿酸鼠祛湿的作用，也为中药作用的多靶点与多途径客观优势提供了理论依据。

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收稿日期：2019-06-16;修回日期：2019-07-29