5 例低磷酸酯酶症患儿临床及遗传学分析

苏 娜 朱 岷 许 珂 张惠姣

1.重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所 儿童发育疾病研究教育部重点实验室 国家儿童健康与疾病临床医学研究中心 儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地 儿科学重庆市重点实验室（重庆 400014）；2.电子科技大学医学院附属妇女儿童医院成都市妇女儿童中心医院儿童遗传与内分泌代谢科（四川成都 610019）

低磷酸酯酶症（hypophosphatasi，HPP，OMIM 146300，241500，241510）是以骨和/或牙齿矿化障碍，血清中组织非特异性碱性磷酸酶（tissue non-specific alkaline phosphatase，TNSALP）活性降低为主要临床特征的一种罕见遗传性疾病，1935 年首次报道，由加拿大儿科医师Rathbun命名，故又称Rathbun综合征。轻型可仅表现为牙齿过早脱落、牙齿骨量减少、牙髓腔变大，而无骨骼异常表现，重型HPP 可出现严重骨骼异常、癫痫发作、继发严重感染、呼吸衰竭及高钙血症而引发死亡，发病率1/300000～1/100000[1-2]。

HPP是由于编码组织TNSALP的ALPL（the liver/bone/kidney alkaline phosphatase gene）基因突变所致，其遗传方式较为复杂，在家系内以常染色体显性或隐性遗传。ALPL基因位于lp 36.1-p 34 上，包含12 个外显子，编码一种磷酸单酯酶TNSALP，后者由524个氨基酸组成，包含活性区、N端螺旋区、同型二聚体结合区、冠状区及钙结合位点5 个结构域[3]，以同型二聚体的形式通过C 端的糖基磷脂酰肌醇（glycophosphatidylinositol，GPI）锚点与细胞膜链接，定向使得活性位点面向胞外环境[4]，广泛存在于各种组织中，尤以骨骼、肝脏、肾脏和发育中的牙齿分布较多。任何引起蛋白质表达、折叠、修饰、转运异常的ALPL基因突变，均可引起TNSALP量和质的改变，从而引起HPP[5]。但TNSALP在骨骼和牙齿矿化中的具体机制还不十分明确[6]。本文回顾分析5例HPP患儿的临床资料，以及高通量测序分析结果。

1 临床资料

5 例HPP 患儿中，男3 例、女2 例，年龄在6 天～2岁5 个月，其中3 例为婴儿型HPP，以骨骼畸形、骨矿化不全（图1）及惊厥为主要临床表现；2 例为儿童型HPP，以身材矮小、牙齿排列紊乱、骨质疏松、长骨干骺端杯口样改变（图2）为主要临床症状。5 例HPP 患儿的具体临床资料见表1。

经医学伦理审核及父母知情同意，采集患儿及其父母的外周血样，送第三方检测公司进行人类全外显子组高通量测序。采用Illumina TruSeq Exome library prep kit 捕获全基因组构建测序文库，HiSeq v 4 SBS 250 cycles测序试剂盒，HiSeq 2500测序平台进行测序。所得的测序数据经生物信息分析，致病性预测（SIFT、Polyphen 2、MutationTaster、PROVEAN 等软件），患儿临床症状对照与家系遗传分析，相关疾病数据库与文献查阅，候选基因突变位点根据ACMG（American College of Medical Genetics）、AMP（American Society of Molecular Pathology）指南进行分类，并进行一代测序（Sanger法）验证。

表1 5例HPP患儿及亲属临床资料

图1 先证者1 影像表现

图2 先证者3 影像表现

5 例HPP 患儿经过测序共鉴定出6 个ALPL基因突变位点（表2）。行Sanger 验证，先证者1 为杂合突变，突变来自母亲；先证者2、3为复合杂合突变，常染色体隐性遗传，父母均为携带者；先证者4纯合突变，常染色体隐性遗传，父母均为携带者；先证者5 位杂合突变，常染色体显性遗传，父亲为患者，突变来自父亲，见图3。未发现新生突变（denovomutation）。6 个突变位点中c.1014_c.1015 ins G、c.1097_c.1099 del CCT、c.1446 C＞A 在千人数据库、dbSNP 数据库及hapmap数据库中未查及相关记载，为首次报道，蛋白质结构预测均为可能有害，ACMG评级为可能致病。

图3 ALPL 基因测序结果

2 讨论

HPP 临床异质性强，轻型易造成漏诊和误诊，重型可危及生命。目前临床分6 型：围生期型、婴儿型、儿童型、成年型、牙型。据国外文献报道，TNSALP水平降低导致磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP）的积累[7]可能会导致一些HPP婴儿和实验敲除ALPL基因小鼠癫痫发作。故婴儿型HPP多在生后 6个月内出现以惊厥等神经系统症状为主的临床表现[8-9]，同时，惊厥也是重型HPP神经系统的首要表现[9]，死亡率高达50%～90%。本研究中3 例婴儿型HPP 具有惊厥等神经系统表现，死亡率100%。由此可见，面对惊厥的患儿，尤其是不明原因反复惊厥，并伴有骨骼异常的患儿，临床医师应高度警惕HPP，并多方搜寻证据，全面分析。

表2 ALPL基因突变位点及Sanger验证

目前，HPP 临床诊断参考指标包括：①血清碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）持续显著降低，且临床症状越重的患者，ALP 活性也越低[9]，但早孕、甲状腺功能减退、贫血等患者也可出现ALP 降低，缺乏特异性；②尿磷酸乙醇胺（phosphoethanolamine，PEA），TNSALP 参与PEA 的代谢，作为代谢底物，PEA 容易检测，但缺乏特异性，一些骨代谢疾病可出现尿PEA 阳性；③胎儿超声，主要针对围生期HPP；④X 线检查示严重骨矿化不足，前臂或股骨突出皮肤的软骨样骨刺，对HPP 具有诊断意义；⑤针对有HPP家族史的高危人群或临床疑诊HPP患者的ALPL基因检测可增加HPP 诊断的准确性。目前，通过基因检测可筛查出 95%的HPP 重症患者[10]，是比血清ALP 检测更可靠的诊断指标。根据ALPL基因突变数据库的统计数据（http://www.sesep.uvsq.fr/03_hypo_mutations.php），截至2019年10月2日，共报告397 种引起疾病的突变。最普遍的突变类型是错义突变，占所有突变的70.0%，其次是小缺失，占11.8%。据笔者统计，目前国内已报道ALPL基因突变42 种，78.57%为错义突变。在除1 号外显子以外的所有外显子区域均有分布[11-15]，主要分布在5、10、12号外显子，分别都有6种突变，同时，国内已报道的病例中有6 例存在c.407位点的不同突变，是否存在突变热点，尚需大样本多中心数据的统计分析。此次发现的突变中4例为错义突变，1例小缺失，1例插入突变。

HPP的基因型和表型的变化都非常大，同一突变的不同患者轻重表型也不一致。本组患儿中先证者1的突变位点为c.346 G＞A，此位点突变的致病性既往已有报道，为齿型HPP，属常染色体显性遗传[16]，研究者还发现该位点突变具有显性负效应[17]。本研究中，先证者1的母亲与先证者1的基因型相同，但患儿母亲仅有ALP 水平降低、骨痛和关节脱位等表现，为成人型轻型HPP，而患儿的临床表现属于婴儿型重型HPP，临床表现型并不一致，分析可能与环境因素与个体差异所致外显不全有关。据既往报道，重型HPP多呈常染色体隐性遗传，但先证者1 的家系遗传学分析呈常染色体显性遗传，其生物学意义与家系遗传学并不相符，分析可能与内含子调控区域的测序盲区有关，同时环境因素与个体差异的作用不能除外，这有待进一步研究。与此同时，先证者3 分别携带了来自父亲的c.1446C＞A和母亲的c.1014至c.1015:插入G突变，为复合杂合突变，根据其年龄和临床表现诊断为儿童型轻型HPP，属轻型。但其父母均为突变携带者且无临床症状，故其遗传方式符合常染色体隐性遗传。因此在遗传咨询上，需警惕少数患儿尽管合并有两个突变，但临床表现型为轻型HPP的可能。先证者2及先证者3携带的c.1014_c.1015ins G、c.1097_c.1099del CCT、c.1446C＞A在千人数据库、dbSNP数据库及hapmap 数据库中未查及相关记载，为首次报道，蛋白质结构预测均为可能有害，ACMG 评级为可能致病，目前正在进行体外细胞功能验证。

综上所述，对于临床疑诊HPP 患儿，应首先检测血清ALP水平，若血清ALP水平持续显著下降，需进一步进行ALPL基因检测，不仅有利于HPP 的早期诊断，也为患儿家庭进行遗传咨询和产前诊断提供重要的理论依据。目前，HPP 发病机制的研究已经取得很大进步，但轻型HPP 的患病率、临床表型与基因型的相关性及调控机制，尚不明确，ALPL基因转录调控区及内含子区域的突变对蛋白质功能的影响等许多问题仍需要进行深入研究。