高效液相色谱法测定铁皮石斛花中总黄酮的含量

农彦彦，吴子瑜，林诗堃，黄 敏，李佳璐，冯才敏

（顺德职业技术学院 轻化与材料学院，广东 佛山 528333）

铁皮石斛为兰科植物，是以热带东南亚为中心向亚热带性气候条件发展的一类植物［1］。铁皮石斛一直与灵芝、人参和冬虫夏草等被列为上品中药，具有清肝明目、益胃生津［2］、滋阴清热、润肺止咳等功效［3］。目前，石斛属植物的研究主要集中在药用部位茎，关于石斛花的研究相对较少。前期研究发现［4-7］，铁皮石斛花含有大量的黄酮类化合物与有机酸类、萜类等资源性成分，这些成分具有较强的生物活性，具有抗氧化、抗衰老、抗炎镇痛、调节免疫的功效。随着石斛种植面积的不断扩大，石斛花资源也不断丰富，越来越多的茶商收购石斛花将其开发成保健品花茶饮用，石斛花制成的花茶口感清香、柔滑，具有清新解郁、缓解精神压力、润肤养颜等多种功效［8-10］。芦丁为石斛花中的主要黄酮类物质，本试验通过探讨石斛花中芦丁含量的测定，建立石斛花活性成分（芦丁）的HPLC 的分析方法，为石斛花的产业开发提供参考，也为扩大石斛药材药用部位提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品

供试石斛花样品由顺德职业技术学院石斛组织培养课题组提供。

1.2 仪器与试剂

Agilent1260 高效液相色谱系统（二极管阵列检测器）；LE204E/02 分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；KQ-500 型 高频数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；A11 basic 分析研磨机（德国IKA）；Express 40 超纯水机（MILLIPORE）

芦丁对照品（纯度：95%，批号：Lot#B1911032，Aladdin）；甲醇（色谱纯）；乙酸（优级纯）。

1.3 溶液制备

1）对照品溶液的制备。

取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含0.1 mg 的溶液。

2）供试品溶液的制备。

取供试品粗粉1.000 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率25 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤。

1.4 色谱条件

色谱柱为Agilent-C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温30 ℃，流动相甲醇∶0.5%乙酸（V/V）为38∶62，流速1 mL/min，进样量 5 μL，检测波长385 nm。理论板数按芦丁计算，不应低于2 000。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器对波长进行扫描，取芦丁对照品溶液，在200～800 nm 波长范围内进行全波长扫描，测得最佳吸收波长为358 nm。此波长处吸收较大，干扰较小。因此，选择358 nm 作为检测波长。

2.2 流动相的选择

分别以甲醇-水溶液，甲醇-0.5%磷酸水溶液，甲醇-0.5%乙酸水溶液作为流动相，同时以甲醇-0.5%乙酸水溶液不同配比对芦丁对照品溶液和样品溶液进行测定。如图1 所示，甲醇-0.5%乙酸水溶液的色谱峰分离效果较好，其中甲醇：0.5%乙酸水溶液=38∶62 配比灵敏度高，峰型平整，分离效果较好。

图1 不同流动相种类对比图谱

2.3 流速的选择

高效液相色谱流速过高，不利于仪器和色谱柱的保护；流速过低，使目标色谱峰的出峰时间延长，拉伸峰型，本实验以改变流速对芦丁对照品进行测定，结果如图2 所示，综合考虑对色谱柱的保护和峰型的平整，试验选择流速为1.1 mL/min。

2.4 进样量的选择

进样量的高低取决了样品的峰面积、保留时间和峰型的平整，本方法分别将自动进样器进样量调为3 μL，5 μL，10 μL，15 μL，20 μL，对芦丁对照品进行测定，结果如图3 所示，综合考虑峰面积、保留时间和峰型，5 μL 进样量为最佳。

图2 不同流速对比图谱

图3 不同进样量对比图谱

2.5 方法学验证

1）方法专属性试验。

分别取芦丁对照品溶液、供试品溶液进行测定，结果见图4 图5。

图4 芦丁对照品谱图

图5 供试品谱图

2）线性关系。

取芦丁对照品溶液，将自动进样器进样量分别调为0.4 μL、0.8 μL、1.2 μL、1.6 μL、2.0 μL，以峰面积（A）为纵坐标，以芦丁质量（ng）为横坐标，进行线性回归，得回归方程。如图6 所示，表明芦丁在0.04～0.2μg 范围内线性关系良好。

图6 芦丁对照品标曲线

3）精密度。

取对照品溶液连续进样5 次，结果见图7，可表明该方法下仪器精密度良好。

图7 对照品重现性

4）重复性。

取铁皮石斛花供试品溶液6 份，进行测定，结果见图8，表明该方法下样品测定的重复性好。

图8 样品重现性

5）回收率。

精密量取铁皮石斛花供试样品液6 份，每份0.5 mL，分别精密加入芦丁对照品溶液0.5 mL，混匀，进样测定，每份测定2 次，计算加样回收率，结果见表1，由表可知，平均加样回收率为 99.38%，该方法测定样品准确度较高。

表1 回收率

2.5 供试品测定

供试品溶液测定铁皮石斛花微花期和盛花期总黄酮含量，由表2 显示，微花期中总黄酮含量比盛花期总黄酮含量高。

表2 供试品测定

3 结论

建立高效液相色谱法测定铁皮石斛花中总黄酮含量（以芦丁计）的方法，芦丁色谱峰峰形对称，在浓度范围内有良好的线性关系，平均加样回收率、精密度、重复性均符合含量测定的要求。

试验建立的HPLC 方法灵敏度高，专属性强，重现性好，适合铁皮石斛花中总黄酮含量（以芦丁计）的测定。同时，试验发现微花期铁皮石斛的黄酮含量比盛花期铁皮石斛黄酮含量高，为石斛花资源开发利用和产品加工提供了参考依据。