数字PCR 应用研究进展

王 哲，雷舒文，段林洁，吕新瑞，古晓奎

（广东顺德工业设计研究院/广东顺德创新设计研究院，广东 佛山 528311）

1983 年Kary Mullis 等发明聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，开启了PCR 时代，促进分子生物学的飞速发展。第一代普通PCR 技术的结果呈现基于凝胶电泳和核酸染料显色。90 年代美国ABI 公司推出第二代PCR 技术：实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR），以其快速、可视化、特异性强、灵敏度高、重复性好等特点，迅速而广泛地占领市场，并在食源病原微生物检测、临床病原微生物检测等领域广泛应用［1-3］。但是荧光定量PCR 定量需要标准品，实际操作中标准样品和实验样品的扩增效率一致性不佳，分析结果严重依赖循环阈值（Ct）等，结果只是相对定量。Vogelstein 和Kinzler 提出“分而治之（divide and conquer）”的理念，即将一个PCR 体系利用有限稀释的方法分割成多个更小的单元，使每个单元最多含有一个目标模板，并对PCR 后的各分区以终点荧光的“有”或“无”作为判断标准，再利用泊松分布进行数据分析，由此发明了第三代能够绝对定量的PCR 技术：数字PCR（Digital PCR，dPCR）。最早的数字PCR 技术是在96 或384 孔PCR板上进行的［4］，反应单元少、实验操作比较繁琐，精度也比较低。有赖于微机电制造技术（MEMS）和微全分析系统技术（μTAS）的长足发展，数字PCR技术在21 世纪初获得了极大发展。2006 年，Ottesen等［5］利用多层软刻蚀技术做出微腔式PCR 芯片，反应单元数增加（最多可实现20 000 总分区数），形成目前所见的由life 公司于2011 年推出的Quant Studio 3D 芯片式数字PCR 的技术雏形。多孔蚀刻芯片式数字PCR 有其结构上的优势，但其存在操作繁琐，手动操作工作量大，实验成本高等缺点，限制了其商业化进程。同时，基于微流控技术的微滴式数字PCR 技术得到了快速的演进，相比于多孔芯片式数字PCR，微滴式数字PCR 技术具有灵活性强（可生成更多数量的液滴），操作简单，检测灵敏度和精度更高等特点，因此应用范围比较广。目前市场占有率较高的产品是2013 年伯乐推出的QX200微滴式数字PCR 仪，液滴数量为20 000 每样本。2012 年Raindance 公司推出Raindrop 数字PCR 仪，分区数达到惊人的10 000 000 液滴，成为行业标杆，后于2017 年被伯乐收购。国内也有多家公司参与数字PCR 设备研发，目前已有数款产品发布。

1 微滴式数字PCR 原理

微滴式数字PCR 实验过程分为3 部分，分别是样本微滴制备、微滴PCR 扩增和微滴荧光信号检测与分析，见图1。在微流控芯片中，以含有目的样本的PCR 反应试剂为分散相，以与水不混溶的油为连续相，将PCR 反应体系分散至上万或数十万甚至上千万个微滴中；然后采用普通PCR 程序进行扩增，扩增结束后，含有目标片段的微滴荧光强度增强，检测为阳性微滴（计为“1”），不含目的片段的微滴荧光值较低，检测为阴性微滴（计为“0”），然后将获得数据通过泊松分布模型进行分析，计算出原始样本中目标基因含量。数字PCR 的定量原理相对简单，不需要标准曲线，即能够对样本中核酸进行绝对的定量。

图1 数字PCR 原理图

2 数字PCR 的应用

微滴式数字PCR 由于其操作简单、成本低、灵敏度高等优点，一经商业化就得到广泛的使用，尤其是在食品安全中的食源性病原微生物和临床分子诊断中的病毒和肿瘤突变基因等的检测中。

2.1 dPCR 在食品安全方面的检测应用

随着社会发展和人民生活水平的日益提升，人们对食品安全问题越来越重视，尤其是对转基因食品的关注，食源致病微生物等问题。相比于传统检测方法，数字PCR 可以在短时间内对样品中目标核酸拷贝数进行绝对定量，具有绝对优势，因此被广泛用于食品安全方面的检测。

转基因食品被批准转商业化应用以来，产品和数量逐年增加，在转基因产品安全评价过程中，转基因产品外源基因拷贝数是分析食品安全检测的重要步骤，目前主要是使用荧光定量PCR 法，需要依据标准物质进行相对定量，无法绝对定量。大豆是重要的转基因农作物，转基因方面研究的也比较多，对比荧光定量PCR 和数字PCR 的多重PCR 体系在4个大豆性状位点转基因系的检测效果，荧光定量的费用会低一点，但是数字PCR 能够更加准确定量，特异性也更好［6］；在加工过的大豆毛油中，利用微滴数字PCR 技术测试三组样品，其中一份含有微量的外源基因，而使用普通PCR 和荧光定量PCR 技术均未检测到外源基因，说明数字PCR 技术更加灵敏，抗干扰能力也更强［7］。另外在研究转基因玉米时，对比荧光定量PCR 和数字PCR 的检测效果，发现数字PCR 更适合检测玉米外源基因与内源基因拷贝数的比率［8］；对比微滴式数字PCR 和芯片式数字PCR 在转基因玉米的双重检测效果，两种方法的定量结果一致，定量限为0.1%，转基因定量检测范围为0.1%～100%，线性度为0.999，精密度优于10%［9］；Dobnik 等［10］建立针对欧盟授权转基因玉米品系检测的多重数字PCR 体系，能够实现大通量检测，节约成本。在转基因水稻G6H1 内源基因的数字PCR 检测中，双重数字PCR 的检测限和定量限分别是3 和25 拷贝，且数字PCR 双重的检测结果优于单重数字PCR 和荧光定量PCR［11］。数字PCR 有更高的灵敏性，对于低丰度样本检测结果好，且对PCR 抑制剂不敏感，所以数字PCR 能更加灵敏检测到微量的外源基因，对半成品样本中的微量外源基因也能准确定量，尤其在测试外源基因含量比率上有独特的优势。

食源性病原菌对人的健康有重要的威胁，常规的检测方法和免疫学方法比较繁琐，耗时耗力，检测灵敏度低，数字PCR 技术的快速灵敏准确特点，能够满足食品病原菌检测的需求。常见的食源性致病菌微生物主要分为细菌性肠道致病菌和食源性病毒。目前已经有多种食源性病原体，如大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌、阪崎肠杆菌、沙门氏菌、诺如病毒等均建立有数字PCR 检测方法［12-14］。水是生活必不可少的资源，其干净与否直接关系着人类健康，马薇等［15］利用数字PCR 通过优化试剂、退火温度等条件，建立起一套检测水中大肠杆菌数量的方法，其检测精度可达每微升单个拷贝数大肠杆菌基因组DNA。董莲华等［14］以大肠杆菌rfbE 基因为靶标，通过优化试剂浓度建立起定量大肠菌O157∶H7 致病菌的数字PCR 方法，其灵敏度比较高，检出限为3 拷贝/20 μL。把数字PCR 技术与抑制死菌DNA 的叠氮溴化丙锭结合，能够快速检测到食品中活的沙门氏菌，相似的方法可以检测食品中活的单核细胞增生李斯特菌［16］。数字PCR 的高灵敏度特征，对环境中低丰度的病原微生物如肠杆菌、沙门氏菌等检测有明显的优势，可推广到其他食源性病原性微生物检测。

2.2 dPCR 在临床上的应用

1）dPCR 在病毒检测应的用。

由于dPCR 在绝对定量上有着非常大的优势，自商业化后，就快速应用在病原微生物的检测上，尤其在病毒定量上应用非常广。临床上病毒载量的精确化是非常重要的，灵敏的检测技术可以指导临床治疗。现已有大量文献报道使用数字PCR 对病毒载量的检测，包括HIV 病毒、HBV 病毒、人博卡病毒、人乳头病毒等。目前AIDS 尚不能治愈，只能通过治疗延长生命，降低传播风险，临床上HIV 检测是测定血浆中其RNA 含量，检测方法还主要是qPCR 技术［17］，dPCR 技术建立的检测方法成倍提高了检出精度，能更早发现是否感染HIV，及早治疗，降低病毒传播风险［18］。而HBV 病毒的感染是全球性的，全球有2.4 亿感染者，是引起肝癌的主要原因之一，HBV 含量对肿瘤的发展有重要的影响，有研究使用dPCR 对临床上131 份石蜡切片样品中HBV含量测定，结果显示拷贝数从1.1～175.5 拷贝/μL 不等，论证分析了HBV 病毒载量、cccDNA 和肿瘤发展之间关系［19］。对于易感婴幼儿的博卡病毒，以其HBo-sh9 基因的保守序列为检测靶标，建立起数字PCR 检测方法，不受样品品质和扩增效率影响，其定量限低至0.5 拷贝/μL，较常规PCR 技术有明显的优势［20］。病毒载量确定影响临床用药治疗，数字PCR 能够准确绝对定量病毒载量，对临床治疗的指导更有意义，所以数字PCR 在病毒方向上的研究会越来越多，应用也会越来越广泛。

数字PCR 技术在动物防疫应用上也得到了及时发展。2018 年在沈阳发现生猪感染非洲猪瘟后，随后在全国快速传播，造成市场猪肉价格高涨。非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的急性传染病，目前的检测方法众多，主要以PCR 和荧光定量PCR 为主，但也存在较多的问题，因此建立数字PCR 检测方法是改善检测技术的有效手段。原霖等［21］借用数字PCR 系统，建立起一套敏感性高于荧光定量PCR，最低限为0.8 拷贝/μL，重复性好的方法，适用于非洲猪瘟的早期筛查。

2）dPCR 在肿瘤个性化检测诊断中应用。

随着科技的发展，人们对肿瘤发生的分子机制认识也越来深入，不同阶段的标志物不断被发现，对仪器设备检测的精度要求也越来越高。数字PCR 能实现绝对定量、稀有突变的检测，在对肿瘤的治疗研究中使用越来越多。数字PCR 具有高灵敏性，可以应用在肿瘤早期诊断。骨髓增殖性肿瘤患者中JAK2 V617F 突变是重要指标，借助数字PCR 技术最低检出率可达万分之一，对于荧光定量技术无法判定的样本，数字PCR 测试结果能够准确做出判定［22］，对比数字PCR 方法和荧光定量PCR 方法在BCR-ABL1的检测精度，数字PCR 的精度比较高，对治疗后期低丰度基因的检测更加灵敏［23］。毛旭华等［24］对比微滴式数字PCR 和扩增阻滞突变系统对外周血中EGFR 基因突变的检测效果，58 例样本结果显示数字PCR 的检出率高，具有更高的敏感性。肿瘤是一种基因病，如非小细胞肺癌患者EGFR 存在多种基因突变情况，只有在19 号外显子缺失或者21 号外显子突变时，采用EGFR 酪氨酸及酶抑制剂才有效果，数字PCR 能够检测低突变率，可提前确定突变类型制定个性化的治疗方案，KRAS 基因的突变与多种癌症的发生有关，KRAS 的突变也是有多个位点，邬升超等［25］人建立多重数字PCR 检测方法，能够准确检测患者血浆中游离DNA 中KRAS 的7 中突变，及早制定治疗方案。数字PCR 不仅可以用于早期癌症突变的筛查，还可以用于治疗过程中监测及愈后监测。随着患者用药治疗，病灶逐渐减小，突变基因的丰度会快速降低，数字PCR 能够高灵敏监测低丰度拷贝数，指导制定合理的停药时间，避免治疗不足或过度治疗。

3 展望

数字PCR 做为核酸分子的绝对定量技术，经过多年的发展，在食品安全中的转基因作物检测、食源性病原微生物的检测有明显的优势，在快速准确检测微量微生物含量的领域得到广泛的应用，在临床应用上，由于其高精度、高灵敏性，对爆发性流行病、基因病的诊断治疗等提供可靠的检测数据，指导临床治疗用药，还可以应用于无创产前诊断、测序文库质控和基因编辑等领域。随科技的发展，数字PCR 技术更加成熟，实验成本会降低，实验操作更加简单自动化，应用的思路也会更广，在微生物定量、基因定量上发挥更大的作用。