不同盐度及两种氮源对盐生杜氏藻的影响

彭家军,崔立兵，马 昆

(内蒙古兰太实业股份有限公司，内蒙古 阿拉善 750333)

内蒙古兰太实业股份有限公司(以下简称“兰太公司”)拥有200多平方千米的内陆盐湖(吉兰泰盐湖)，具有丰富的卤水资源。该地干旱少雨，全年光照时间长，昼夜温差大，特别适合9-cis营养物质的积累，经以色列威兹曼研究所检测，吉兰泰盐藻中9-cis营养物质和全反式β-胡萝卜素达到了1 ∶1比例的黄金配比。具有培养杜氏藻生产β-胡萝卜素得天独厚的自然条件。

目前，盐度为影响盐藻生长和β-胡萝卜素积累的主要环境因子之一。盐度和营养盐是盐藻室外大规模培养中仅有的两个可控因子。明确盐藻对不同盐度的吸收规律和盐藻生长的两阶段(生物量合成阶段和β-胡萝卜素积累阶段)对氮盐种类和浓度的不同要求对建立盐藻β-胡萝卜素高产控制模式有直接的指导意义。

对盐藻资源的开发主要是利用其细胞内的β-胡萝卜素和甘油。天然β-胡萝卜素呈9-顺式、15-顺式与全反式混合构型，不仅能转化为维生素A，而且具有淬灭体内自由基、防止衰老以及癌变、防治心脑血管疾病、青光眼、白内障并增强人体免疫力等功效，因而具有广阔的应用前景。自然界中β-胡萝卜素分布很广，但一般含量极微。单细胞绿藻盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)在人工控制和胁迫条件下，能大量积累β-胡萝卜素(占干重的10%～14%)，被公认为是生产β-胡萝卜素的理想天然资源。美国、澳大利亚、以色列、日本、西班牙、加拿大等国较早就开展了杜氏藻的基础理论研究并投入生产和工业化养殖。我国的杜氏藻研究和大规模养殖始于20世纪80年代，养殖业主要分布在内蒙、天津和甘肃等地。

文章研究了盐度对杜氏藻生长、色素积累的影响，以期为优化杜氏藻生产工艺、提高杜氏藻及其β-胡萝卜素产量提供参考。

1 材料与方法

1.1 藻种

藻种。盐生杜氏藻Dunaliellasalina来自中国海洋大学海洋生命学院分离的内蒙古“北京2#”种，原种来自以色列。

1.2 培养条件

(1)培养液。来自兰太公司生产基地的饱和卤水与蒸馏水配制的不同浓度培养液。一次性添加KH2PO40.1 mmol/L, 柠檬酸铁0.01 mmol/L, NaHCO32 mmol/L。

(2)盐度和氮源。第一组 NaNO30.8 mmol/L，盐度(饱和卤水体积/培养液总体积)：30%、40%、50%、60%、70%。

第二组 CO(NH2)20.4 mmol/L，盐度(饱和卤水体积/培养液总体积)：30%、40%、50%、60%、70%(依次对应瓶号1#～5#)。

(3)温度—空调控温22 ℃±1 ℃。

(4)光照—日光灯源光照，光/暗为14 h/10 h。

(5)其它用250 mL三角烧瓶培养，藻液体积150 mL。取对数生长期藻种接种。接种密度15×104cell/mL。每天摇瓶6次。试验设五个水平样，重复两次。

1.3 测定指标和测定方法

(1)细胞计数。血球计数板法计数，每个样计3次，取其平均数，每天计数一次。

(2)β-胡萝卜素的测定[4]。5 mL藻液→90%丙酮萃取→上清液→定容50 mL→721分光光度计测OD450值。

β-胡萝卜素含量(mg/L)=(定容体积×10×OD450)×1 000÷(2 500×取样体积)。体积单位均为毫升(mL)。

(3)叶绿素(a、b)的测定[4]。5 mL藻液(加入1 g NaCl)→90%丙酮萃取→上清液→定容50 mL→721分光光度计分别测OD663、OD645值。

叶绿素含量(mg/L)=(8.02×OD663+20.21×OD645)×定容体积÷取样体积。

2 结果

2.1 盐度及氮源对杜氏藻生长的影响(表1、图1、表2、图2)

表1 NaNO3作为氮源,不同盐度培养液杜氏藻细胞密度Tab.1 Cell density of Dunalliella Salina in different salinity culture medium with NaNO3 as nitrogen source ×104 cell·mL-1

图1 NaNO3作为氮源盐度对盐藻的影响Fig.1 Effect of salinity of NaNO3 as nitrogen source on Dunaliella Salina

图1所示，在实验范围内，以NaNO3作为氮源，30%盐度对杜氏藻生长最合适。细胞最大密度为44.8×104cell/mL，其40%组最大密度为36.5×104cell/mL，50%组最大密度为34.1×104cell/mL，60%组细胞密度最大密度为30.7×104cell/mL，70%组细胞密度总体水平仍是最低的。图1所示杜氏藻最高密度44.8×104cell/mL出现在30%盐度，70%对杜氏藻生长有抑制作用。

图2所示在实验范围内，以CO(NH2)2作为氮源，30%盐度对杜氏藻生长最合适。细胞最大密度为47.5×104cell/mL，其40%组最大密度为46.0×104cell/mL，50%组最大密度为35.8×104cell/mL，60%组细胞密度最大密度为30.2×104cell/mL，70%组细胞密度23.7×104cell/mL总体水平仍是最低的。图2所示对杜氏藻最高密度47.5×104cell/mL出现在30%盐度，70%对杜氏藻生长有抑制作用。

表2 CO(NH2)2作为氮源,不同盐度培养液杜氏藻细胞密度Tab.2 CO(NH2)2 as nitrogen source, cell density of Dunaliella Salina in different salinity culture medium ×104 cell·mL-1

图2 CO(NH2)2作为氮源盐度对盐藻的影响Fig.2 Effect of salinity of CO(NH2)2 as nitrogen source on Dunaliella salina

2.2 盐度对杜氏藻β-胡萝卜素积累的影响

图3显示了10 d实验结束时不同盐度及两种氮源对杜氏藻的β-胡萝卜素含量的影响。可以看出，盐度50%对杜氏藻来说，有最大的β-胡萝卜素含量(10.8 mg/L)，70%盐度组有最低的β-胡萝卜素含量(4.0 mg/L)，说明盐度对β-胡萝卜素积累有促进作用。另外容易看出，盐度50%积累β-胡萝卜素的能力高于60%，说明高盐度不适合β-胡萝卜素含量的积累。图3显示尿素和硝酸钠两种氮源对盐藻生长没有明显差异，但对盐藻积累β-胡萝卜素，尿素相对于硝酸钠效果好。

图3 第11 d胡萝卜素含量柱形图Fig.3 Column chart of carotene content on the 11th day

2.3 盐度对杜氏藻叶绿素a合成的影响

图4显示了共10 d叶绿素a硝酸钠和尿素合成达高峰时对杜氏藻藻液叶绿素a的浓度。可以看出，对硝酸钠来说，最大叶绿素a含量12.2 mg/L出现在30%组中，70%组有最低的叶绿素a含量(4.60 mg/L)；对尿素来说，最大叶绿素a含量10.8 mg/L出现在50%组中，40%组有最低的叶绿素a含量(4.6 mg/L)；说明盐度对叶绿素a合成有促进作用。

图4 第11 d叶绿素含量柱形图Fig.4 Column chart of chlorophyll content on the 11th day

3 讨论

盐生杜氏藻(DunaliellaSalina)是唯一能在高浓度卤水中生长的具有可观经济价值的藻类生物，其在特殊环境下天然胡萝卜素转化富集量可以达到生物总量的10%以上。盐藻养殖是医疗、保健、化妆、高档饵料等领域获取纯天然胡萝卜素的主要手段。应用现代先进工艺方法从盐藻中提取蛋白质、多糖、氨基酸、食用色素、不饱和脂肪酸等天然有效成分在生物化工和大健康领域具有广阔的应用前景。

从细胞增长率、叶绿素及胡萝卜素增长率虽盐度变化曲线看出：盐藻养殖盐度为30%(9 °Be′)和40%(12 °Be′)培养液中盐藻生长速率较快。高盐度(15 °Be′以上)对盐藻细胞分裂有明显抑制作用。但高盐度有利于盐藻积累β-胡萝卜素。因此，室外大规模养殖盐藻最适宜盐度范围40%～50%(12 °Be′～15 °Be′)。但养殖周期不能过长(10 d以上)，因为此盐度范围内其他藻类和原生动物有可能适应而泛滥。

尿素和硝酸钠两种氮源对盐藻生长没有明显差异，但对盐藻积累β-胡萝卜素，尿素相对于硝酸钠效果好。

实验过程中笔者认为出现以下几个问题：盐藻生长速率总体较缓慢；β-胡萝卜素积累较低(一般情况下10 mg/L～13 mg/L)；叶绿素含量大部分高于β-胡萝卜素含量，原因可能是氮浓度高而光强低。杜氏藻生长的两阶段对光照、温度、盐度、营养盐等环境因子要求显著不同。研究表明，杜氏藻生长和β-胡萝卜素积累阶段对盐度的要求明显不同。即先用较低的盐度和光照及较高的氮盐条件使藻增殖至较理想的密度，再提高盐度和光照、降低pH值胁迫β-胡萝卜素的积累。

另外，有研究表明：盐度的改变还可能影响到盐藻藻体中HCO3转化为CO2碳酸酐酶(CA)的活性，在适合盐度的范围内，体内表面碳酸酐酶的活性较强；盐度的变化导致膜脂肪酸种类及含量变化，影响膜的透性，改变其生理状况。