急性缺血性脑卒中患者血清HIF-1α、AQP9水平与出血转化的相关性分析

成旭静，耿红艳，刘新静

急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke，AIS)又称急性脑梗死(cerebral infarction，CI)，是由于脑动脉闭塞导致的脑组织梗死，是目前临床致死率和致残率极高的一种中枢神经系统血管事件[1，2]。出血转化(hemorrhagic transformation，HT)是发生在AIS后梗死区内继发性出血，是AIS一种严重并发症，可导致患者病情恶化、预后差，因此早期评估AIS患者HT发生的风险意义重大[3]。缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor -1 α，HIF-1α)是在缺氧条件下维持组织细胞存活、细胞稳态的主要核转录因子，与神经细胞损伤修复、AIS严重程度及预后密切相关[4，5]。水通道蛋白9(aquaporin 9，AQP9)存在于线粒体内膜，对脑组织能量平衡具有一定调节作用，与脑缺血缺氧程度及脑水肿呈正相关[6，7]。研究报道，HIF-1 α、AQP9水平与缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织水肿及神经细胞凋亡有关[8]，然而关于二者与AIS患者HT的相关性尚鲜有报道。基于此，本研究拟通过检测AIS患者血清HIF-1 α、AQP9水平，探究其与HT的相关性及对AIS患者发生HT的早期预测价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017年10月～2019年4月本院收治的183例AIS患者，根据复查CT检测结果分为HT组(84例)和非HT组(99例)。患者纳入标准：(1)符合《2010年中国急性缺血性脑卒中诊治指南》中关于AIS诊断标准[9]；(2)均经头颅CT或核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)证实；(3)均行静脉溶栓治疗；(4)均首次发病且在4.5 h内入院；(5)入院前首次CT检查未发现出血，发病7 d～14 d复查发现低密度区内高密度影为发生HT判定标准。排除标准：(1)合并严重肝、肾疾病或发病1 m内出现心肌梗死者；(2)合并感染性疾病或自身免疫性疾病者；(3)合并恶性肿瘤者；(4)有颅脑手术史并发生脑梗死或脑出血者。

1.2 方法

1.2.1 资料收集 收集所有受试者入院后记录基线资料，主要包括患者性别、年龄、体质量指数(body mass index，BMI)、高血压史、糖尿病史、高血脂症史及入院治疗前急诊基线美国国立卫生研究院卒中量表(national institutes of health stroke scale，NIHSS)评分、基线收缩压、基线舒张压、基线血糖、溶栓时间窗、血清标本等资料。

1.2.2 血清HIF-1α、AQP9水平检测 采用免疫印迹(western blot，WB)检测血清HIF-1α、AQP9蛋白表达水平。采用蛋白抽提试剂盒(货号：P0028，上海碧云天有限公司)提取血清总蛋白，BCA试剂盒检测(货号：P0010S，上海碧云天有限公司)蛋白浓度，置于-80 ℃保存备用。取60 g蛋白样品，6% SDS-PAGE电泳2 h，PVDF膜转膜70 min。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，添加兔源一抗anti-HIF-1α抗体(货号：ab216842，稀释比1∶500，英国Abcam公司)，anti-AQP9抗体(货号：ab15127，稀释比1∶1000，英国Abcam公司)，anti-GAPDH抗体(货号：ab181602，稀释比，英国Abcam公司)4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次，添加二抗羊抗兔IgG(货号：ab205718，稀释比1∶5000，英国Abcam公司)室温孵育1.5 h，按上述方法洗膜，显色，曝片，观察结果并进行分析。

2 结 果

2.1 HT组与非HT组AIS患者基线资料比较 HT组与非HT组AIS患者性别、年龄、BMI、高血压比例、糖尿病比例、高血脂症比例差异均无统计学意义(P>0.05)。与非HT组比较，HT组AIS患者基线NIHSS评分、基线收缩压、基线舒张压、基线血糖、溶栓时间窗均显著增加(P<0.05)(见表1)。

表1 HT组与非HT组AIS患者基线资料比较例(%)]

表1续 HT组与非HT组AIS患者基线资料比较例(%)]

2.2 HT组与非HT组AIS患者血清HIF-1α、AQP9蛋白水平比较 与非HT组比较，HT组AIS患者血清HIF-1α、AQP9蛋白水平均显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)(见表2、图1)。

图1 WB检测血清HIF-1α、AQP9蛋白表达

表2 HT组与非HT组AIS患者血清HIF-1α、AQP9蛋白水平比较

2.3 HT组AIS患者血清HIF-1α、AQP9蛋白水平的相关性 Pearson分析结果显示，HT组AIS患者血清HIF-1α、AQP9蛋白水平成正相关(r=0.679，P<0.05)(见图2)。

图2 HT组AIS患者血清HIF-1α、AQP9蛋白水平的相关性

2.4 Logistic回归分析影响AIS患者发生HT的危险因素 以是否发生HT为因变量(是=1，非=0)，以NIHSS评分、基线收缩压、基线舒张压、基线血糖、溶栓时间窗、血清HIF-1α、AQP9蛋白水平为自变量进行Logistic回归分析，结果显示，NIHSS评分、溶栓时间窗和血清HIF-1α、AQP9蛋白水平是AIS患者溶栓后发生HT的独立危险因素(P<0.05)(见表3)。

表3 Logistic回归分析影响AIS患者发生HT的危险因素

2.5 NIHSS、溶栓时间窗、血清HIF-1α、AQP9水平对AIS患者发生HT的预测价值 分别以NIHSS、溶栓时间窗、血清HIF-1α、AQP9水平为检测变量绘制ROC曲线发现曲线下面积(area under the curve，AUC)分别为0.707(95%CI：0.632～0.782)、0.790(95%CI0.721～0.859)、0.881(95%CI0.829～0.932)、0.869(95%CI0.814～0.924)，截断值分别为13.39分、296.31 min、0.33、0.32，灵敏度分别为44%、66.70%、86.90%、83.30%，特异度分别为91.90%、87.90%、87.90%、88.90%。另采用SPSS 25.0软件的联合应用理论模式：基于本研究样本资料，对各单独应用指标进行综合Logistic回归，再依据所得参数(β分别为0.578、0.025、7.711、8.036)，归一化加权计算并对应处理各样本资料，并据其进行联合应用的ROC分析。结果显示NIHSS、溶栓时间窗、血清HIF-1α及AQP9水平联合应用预测AIS发生HT AUC为0.980，灵敏度和特异度分别为94.00%和94.90%，显然该联合模式，其诊断效能比单一指标均有明显提高(见图3)。

图3 NIHSS、溶栓时间窗、血清HIF-1α、AQP9水平预测AIS患者发生HT的ROC曲线

3 讨 论

HIF-1是由α、β两种亚基组成的异源二聚体，HIF-1α是一种氧调节亚基，广泛存在于哺乳动物细胞，通常情况下HIF-1α在细胞中可被迅速降解，含量极少，缺氧状态下，HIF-1α水解酶活性降低，导致HIF-1α累积，进而启动一系列机体对缺氧环境的适应性反应，促进低氧环境下细胞存活及增殖，发挥神经保护作用[10]。脑出血后，大脑组织将呈现能量代谢改变、电解质平衡紊乱等状态，研究证实水通道蛋白家族(aquaporins，AQPs)广泛存在于各种细胞器官的细胞膜及细胞器膜上，其中AQP9在脑水肿发病中研究较多，与电解质平衡紊乱等有关[11，12]。Ding等[13]研究报道，由锰超氧化物歧化酶表达为标志物指示脑外伤后缺氧状态发现，缺氧环境可促进HIF-1α表达，进而上调AQP9表达。姚璐等[8]研究报道，灯盏乙素可降低缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织HIF-1α、AQP9表达，抑制神经细胞凋亡，减轻大鼠脑组织水肿。本研究结果发现，与非HT组比较，HT组AIS患者血清HIF-1α、AQP9水平显著升高，且二者成正相关，提示HIF-1α、AQP9可能协同影响AIS患者合并HT发生。

目前临床早期(3 h～4.5 h内)对AIS患者采取溶栓治疗可有效改善AIS患者预后，但由于有效时间窗的限制，临床实际应用中获救人数仍占少数。AIS患者脑缺血再灌注损伤是导致溶栓治疗率低的主要原因之一。HT是AIS患者脑血管内皮受损而使红细胞外渗的结果，是溶栓后主要危险并发症，可进而启动一系列氧化应激反应，导致缺血再灌注羟自由基形成并产生神经毒性，引起血脑屏障通透改变，从而导致脑组织水肿，造成缺血半暗带增加及内环境紊乱。徐耑等[14]研究报道，基线收缩压高、基线NIHSS评分较高、早期头部CT有缺血改变、溶栓24 h内血压变异性大是房颤患者静脉溶栓后发生HT的危险因素。王凯等[15]研究报道，AIS患者伴重度脑微出血是AIS患者预后不良的独立危险因素。本研究结果显示，与非HT组比较，HT组AIS患者基线NIHSS评分、基线收缩压、基线舒张压、基线血糖、溶栓时间窗均显著增加，且NIHSS评分、溶栓时间窗和血清HIF-1α、AQP9水平增加均是引起AIS患者发生HT的独立危险因素，提示血清HIF-1α、AQP9水平及临床基线资料可能对AIS患者发生HT预后评估具有重要价值。本研究进一步采用ROC分析NIHSS、溶栓时间窗、血清HIF-1α、AQP9水平预测AIS患者发生HT结果显示，AUC分别为0.707、0.790、0.881、0.869，截断值分别为13.39分、296.31 min、0.33、0.32，灵敏度分别为44%、66.70%、86.90%、83.30%，特异度分别为91.90%、87.90%、87.90%、88.90%。四者联合应用预测AIS发生HT AUC为0.980，灵敏度和特异度分别为94.00%和94.90%，显然该联合模式，其诊断效能比单一指标均有明显提高。提示检测血清HIF-1α、AQP9水平联合临床NIHSS、溶栓时间窗指标可能对临床预测AIS发生HT有更好的参考价值。

综上所述，血清HIF-1α、AQP9水平升高可能与AIS患者发生HT有关，且是影响AIS继发HT的独立危险因素，二者联合检测对AIS发生HT具有一定预测价值。但由于本研究样本量少，存在不足，另关于血清HIF-1α、AQP9水平预测AIS发生HT最佳截断值尚不清楚，后期有待进一步深入探究。