甘草地上部分总黄酮不同提取方法及其抗氧化活性研究*

薄颖异，张玥辉，杨 柳，崔 洁，王文全，，3，侯俊玲，3

（1.北京中医药大学，北京 102488；2.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；3.中药材规范化生产教育部工程研究中心，北京 100102）

甘草又名国老，《中华人民共和国药典》中记载为豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）的干燥根和根茎[1]。甘草据史料记载，最早产于东北三省，现多集中分布在西北、东北、华北地带，主要是以新疆、内蒙古自治区，甘肃等地为主要产区[2-4]。甘草应用于古方当中已有近千年。更有“十方九草”、“无草不成方”之说，故称“国老”。

甘草传统入药部位是根及根茎，但其地上部分资源同样丰富，据文献报道适当割取地上部分有利于根及根茎活性物质的积累[5-6]；且其黄酮类活性成分具有诸多药理活性，例如抗氧化[7-8]、抑制肿瘤细胞和癌细胞的生长和发展[9-10]、雌性激素样作用，对前列腺炎，病原微生物感染、肝损伤、消化系统疾病、痉挛及变态反应等症状具有良好疗效[11-14]。

为进一步开发利用新资源，全面高效的提取方法的研究必不可少，因黄酮类化合物结构和种类的多样性，提取方法也是多种多样，常见的有溶剂提取法[15]、超声提取法[16-17]、浸渍法[18]、超临界萃取[19]等方法；然而国内提取方法研究大多局限于实验室，并未涉及实际生产领域。

在此背景下，研究首次将工厂提取方法与实验室提取方法进行对比考察，并因其成分多样，故加入不同提取溶剂提取进一步对比研究；工厂提取方法常见为回流提取，实验室提取方法常见有水煎煮，超声提取，回流提取，故本实验将一同比较上述提取方法；为了全面对比甘草地上部分活性成分，根据相似相溶原理，提取溶剂的选择按照极性由大到小设计为乙醇，正丁醇，乙酸乙酯，石油醚；本实验以总黄酮提取率作为评价指标，并通过体外抗氧化活性评价了甘草地上部分总黄酮的1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）清除能力及还原力，从而筛选出最适提取方法及提取溶剂，为后续甘草地上部分开发利用奠定理论基础，提供切实可行的提取方案。

1 材料与方法

1.1 实验原材料 甘草地上部分来自甘肃省酒泉市瓜州县河东乡2018年9月采收的甘草地上部分，材料由中国医学科学院药用植物研究所王文全教授鉴定为甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.，也称乌拉尔甘草）的干燥地上部分；采收样品经自然阴干和磨粉机粉碎，然后过40目筛常温干燥器内贮存备用。

1.2 实验试剂 水（娃哈哈集团有限公司）；甲醇（美国FISHER公司，色谱纯）；乙腈（美国FISHER公司，色谱纯）；甲醇（分析纯，北京化工厂）；乙醇（分析纯，北京化工厂）；正丁醇（分析纯，北京化工厂）；乙酸乙酯（分析纯，北京化工厂）；石油醚（分析纯，北京化工厂）；氢氧化钾（分析纯，北京化工厂）；槲皮素（色谱纯，上海源叶生物科技有限公司）；DPPH（东京化成工业株式会社生产）；磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH 6.6，上海源叶生物科技有限公司）；铁氰化钾（分析纯，上海源叶生物科技有限公司）；三氯乙酸（分析纯，罗恩试剂）；三氯化铁（分析纯，北京百灵威科技有限公司）。

1.3 实验仪器 40目标准检验筛（筛孔直径0.45mm，北京祥宇伟业仪器设备有限公司）；CP224C电子天平（奥豪斯上海仪器有限公司）；BJ-150型粉碎机（德清拜杰电器有限公司）；KH-500DE型数控超声波清洗器（北京鑫科奥科技有限公司）；UV-2600紫外可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）；精宏DZF-6050真空干燥箱（上海和呈仪器制造有限公司）；鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司101-2AB）；湘仪H1650离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。

1.4 数据处理软件 实验数据采用SAS9.3采用软件分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 实验方法

2.1 总黄酮提取率测定

2.1.1 对照品制备 精密称取槲皮素标准品0.0222g，以少量甲醇溶解，后定容于100 mL棕色容量瓶中，配制成浓度为0.222 0 mg/mL的标准溶液，4℃冰箱冷藏保存[20-21]。

2.1.2 标准曲线制备 分别精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.2和1.8 mL的槲皮素溶液于10 mL容量瓶中，甲醇补足至2 mL，加入10%氢氧化钾（KOH）溶液1mL，充分摇匀，静置5 min，用娃哈哈纯净水定容至刻度，充分摇匀后于400 nm处测定吸光度值。以吸光度A为纵坐标，槲皮素浓度C为横坐标，用EXCEL绘制标准曲线，得回归方程：Y=30.473X-0.011（r2=0.999 4），结果表明槲皮素浓度在 0.259～1.211 mg/mL范围内呈现良好的线性关系。

2.1.3 总黄酮提取率测定 精密称取总黄酮提取物0.100 0 g，适量甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中。精密量取提取物溶液0.25 mL于10 mL容量瓶中，按照2.1.2中方法进行显色并测定其吸光度，根据上述标准曲线计算总黄酮提取率。

2.1.4 总黄酮提取率计算公式

其中y代表总黄酮提取率（mg/g），c代表提取物浓度（mg/mL），m代表称取的提取物的量（mg），M2代表提取后所得提取物的量（mg），M1代表提取原药材的量（g）。

2.2 不同提取方法对比

2.2.1 水煎煮提取 精密称取甘草地上部分粉末5.000 0 g于100 mL圆底烧瓶中，温度100℃，液料比10∶1，提取时间90 min，提取2次。过滤，合并滤液，干燥，称质量。计算出膏率及总黄酮提取率。重复3次。

2.2.2 实验室回流醇提 精密称取甘草地上部分粉末5.000 0 g于100 mL圆底烧瓶中，提取温度75 ℃，液料比 10∶1，70%乙醇溶液，提取时间 90 min，提取2次。过滤，合并滤液，干燥，称质量。计算出膏率及总黄酮提取率。重复3次。

2.2.3 实验室超声醇提 精密称取甘草地上部分粉末5.000 0 g于100 mL锥形瓶中，提取温度75℃，功率500 W，70%乙醇溶液，液料比10∶1，提取时间30 min，提取2次。过滤，合并滤液，干燥，称质量。计算出膏率及总黄酮提取率。重复3次。

2.2.4 工厂回流醇提 称取甘草地上部分粗粉50.000 kg，提取温度 75 ℃，液料比 6∶1，70%乙醇溶液，提取时间90 min，提取2次。过滤，合并滤液，干燥，称质量。计算出膏率及总黄酮提取率。

2.3 提取溶剂考察[22]精密称取甘草地上部分粉末8.000 0 g于100 mL锥形瓶中浸渍，液料比10∶1，提取时间24 h，提取1次，分别使用无水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚进行提取。过滤，合并滤液，干燥，称质量。计算出膏率及总黄酮提取率。重复3次。

2.4 体外抗氧化能力测定

2.4.1 DPPH清除能力的测定 准确称取一定量的甘草地上部分提取物物粉末，分别加入相应量的甲醇配制成 0.1、0.2、0.3、0.4 和 0.5 mg/mL 的待测样品溶液。准确称取DPPH试剂45 mg，以无水乙醇溶解至1 000 mL容量瓶，充分摇匀，即得0.045 mg/mL DPPH溶液，避光低温保存。分别取1 mL待测样品溶液和3 mL DPPH溶液混合摇匀，室温且避光反应30 min，于517 nm波长下测定其吸光度值。以待测液溶剂为空白对照，记为A空白；1 mL待测样品溶剂和3 mL DPPH溶液混合物，记为A对照；1 mL待测样品溶液和3 mL DPPH溶液，记为A样；计算样品自由基清除率[23-24]。

2.4.2 还原力的测定 准确称取一定量的甘草地上部分提取物物粉末，分别加入相应量的甲醇配制成 0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 mg/mL 的待测样品溶液。分别取待测样品溶液1 mL和2 mL浓度为0.2 mol/L的磷酸缓冲溶液（pH=6.6）和1 mL的1%铁氰化钾溶液，得混合物A，在50℃水浴保温20 min，然后加入2 mL的10%三氯乙酸溶液，在3 000 r/min条件下离心15 min。取上清液2 mL，加入2 mL蒸馏水及0.5 mL的0.1%三氯化铁溶液，得混合待测物B，于700 nm波长下测吸光度[25-26]。

吸光度值越大，样品的还原力越强。

3 结果与分析

3.1 不同提取方法对甘草地上部分总黄酮提取率的影响 水煎煮作为最原始的提取方法，具有设备简单，溶剂易得的优点；超声提取作为实验室常用的提取方法，能够快速破坏植物的细胞，加速药材在提取溶剂中的溶解，提取效率高；回流提取作为传统常规提取方法，与水煎煮相比，不易挥发，且能充分提取，生产时常常采取此方法。工厂提取设备巨大，投料较为粗放，无法控制是否会有茎和果实等杂质，且料液比及温度等条件都难以达到实验室内的精细条件，从而活性成分的提取会受到相应的影响。

总黄酮提取率由高至低依次为回流实验室醇提＞实验室超声醇提＞回流工厂醇提＞水煎煮法。出膏率由高至低依次为回流实验室醇提＞实验室超声醇提＞回流工厂醇提＞水煎煮法，见表1。

表1 不同提取方法的甘草地上部分总黄酮提取率和出膏率

实验室超声醇提与实验室回流醇提之间没有显著性差异，但两者所用时间差距明显，后续实验可根据目的进行方法选择；实验室回流醇提与工厂回流醇提具有显著性差异，证明工厂生产提取与实验室提取有一定差距，具有一定的损失；水煎煮法的出膏率高、黄酮提取率低，表明其提取的大多为大极性物质，多糖和蛋白质类杂质比较多，应用价值不高；而其余3种提取方法所得提取物较水煎煮法相比成分更加全面均匀。数据表明实验室超声提取或回流提取提取效果较好。

3.2 不同提取溶剂对甘草地上部分总黄酮提取率的影响 按照相似相溶原理，极性越大的试剂越能提取出极性大的物质，反之亦然。

总黄酮提取率由高至低依次为乙酸乙酯提取＞正丁醇提取＞乙醇提取＞石油醚提取，每组数据之间均有显著性差异。出膏率由高至低依次为乙醇提取＞正丁醇提取＞乙酸乙酯提取＞石油醚提取，每组数据之间均有显著性差异，见表2。

表2 不同提取溶剂甘草地上部分总黄酮提取率和出膏率

数据表明，乙醇能提出较多的黄酮但也能提出部分多糖，所以造成黄酮提取率较低，结合出膏率数据，总黄酮量较高；正丁醇和乙酸乙酯的黄酮提取率较高，但出膏率一般，且有机试剂价格高，有毒性。石油醚结合总黄酮提取率和出膏率数据，提取得到的黄酮类活性成分非常少，不予考虑。综上，考虑经济效益及安全性，选择乙醇比较恰当。

3.3 体外抗氧化能力测定结果分析

3.3.1 DPPH清除能力结果分析 DPPH自由基是一种稳定的自由基，自由基清除剂与DPPH的单电子配对，随其浓度降低颜色会逐渐褪色，颜色越浅，吸光度越小，表明DPPH清除率越高，抗氧化能力越强。

如表3所示，以VC作为对照品，随着浓度依次递增，VC和不同提取方法所得受试物的DPPH清除能力也随之增强，呈现先上升后平稳的趋势。在所有受试物中，VC作为对照品，其DPPH清除能力最强；工厂回流醇提较实验室超声或回流相比稍高，或许因其提取量大，混合不均匀，导致取样部分黄酮浓度稍高，或与其实验本身有关，DPPH极易氧化，造成数据不稳；水煎煮法所得黄酮提取率最低，相同浓度下所含黄酮量最少，其DPPH清除能力最弱。

如表4所示，以VC作为对照品，随着浓度依次递增，VC和不同提取溶剂所得受试物的DPPH清除能力也随之增强，呈现先上升后平稳的趋势。在所有受试物中，乙酸乙酯提取受试物的DPPH清除能力基本与VC相当，乙醇与正丁醇稍低；与上述水煎煮法同理，石油醚提取受试物的DPPH清除能力最弱。

3.3.1 还原力结果分析 还原力可以在某些方面代表物质的抗氧化能力，现被广泛应用于抗氧化活性相关研究中[27]。

在700 nm波长条件下测定其吸光度值，吸光度值越大，样品的还原力越强。

如表5所示，以VC作为对照品，随着浓度依次递增，VC还原力基本稳定；不同提取方法所得受试物的还原力也随之增强，呈现先上升后平稳的趋势。在所有受试物中，VC作为对照品，其还原力最强；实验室回流醇提与实验室超声醇提基本相当，工厂回流醇提稍差；水煎煮法所得黄酮提取率最低，相同浓度下所含黄酮量最少，其还原力最弱。

如表6所示，以VC作为对照品，随着浓度依次递增，VC还原力基本稳定；不同提取溶剂所得受试物的还原力也随之增强，呈现先上升后平稳的趋势。在所有受试物中，VC的还原力最强；样品中乙酸乙酯同样是还原力最强的，正丁醇和乙醇稍低；与上述水煎煮法同理，石油醚提取受试物的还原力最弱。

4 结论与讨论

文章通过对比不同提取方法及不同提取溶剂，以总黄酮提取率及抗氧化活性为评价指标，优选出提取效果较好的提取方法和提取溶剂。实验室超声醇提和实验室回流醇提效果较好，可根据实际情况进行选择；考虑经济效益及安全性，最适提取溶剂为乙醇；所得黄酮提取物都具有一定的抗氧化活性，且存在量效依赖关系。

表4 不同提取溶剂提取物的DPPH清除率

表5 不同提取方法提取物的还原力测定

表6 不同提取溶剂提取物的还原力测定

若可以着重研究这几种方法或者试剂所得提取物的成分及含量区别，可以更好地开展分类黄酮的富集，不同类别的黄酮的抗氧化活性可以进一步研究，以此做到具有针对性的抗氧化剂的开发，为药食两用甘草植物资源的开发利用奠定理论基础，可将其广泛应用于其他相关领域。