乌梅提取液对口腔变形链球菌的体外抑制作用研究*

徐俊峰 董艳蓉徐婉君 方建红 李莎莎 平依林 王晓燕

浙江省立同德医院 浙江 杭州 310012

龋齿主要由链球菌属引起，而变形链球菌已被公认为是最主要的致龋菌。目前，龋病的治疗方法均存在或多或少的局限性，而天然植物来源的抗菌剂来替代或丰富现有的化学性抗菌漱口水的研究正越来越受到关注，中药对口腔致病菌的抑菌研究也成为热点之一[1]。中药乌梅为蔷薇科植物梅的干燥近成熟果实，也是药食同源的一味中药。《本草纲目》中记载：“下气，除热烦满，安心，止肢体痛，偏枯不仁，死肌，去青黑痣，蚀恶肉（《本经》）。去痹，利筋脉，止下痢，好唾口干（《别录》）。”现代药理研究认为，乌梅具有抗菌、保护肝功能、抗氧化、免疫调节、抗过敏等作用[2]。本研究以乌梅肉水提取液为研究对象，研究其对口腔变形链球菌的抑制作用，为今后进一步开发乌梅口腔抗菌药物提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料：乌梅(Fructus mume，批次：180315)购自亳州磊硕生物科技有限公司，经本院中药房鉴定为正品。变形链球菌（Streptococcus mutans,MS.）(ATCC700610)菌株购自于美国ATCC。牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉、脱水牛心浸粉、脱水小牛脑浸粉、葡萄糖、NaCl、MTT、二甲亚砜、T型涂布棒、90mm玻璃培养皿等。

1.2 仪器：电热恒温培养箱(沧州豪威机电有限公司)，超净工作台(苏净安泰公司)，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，高压蒸汽灭菌锅［浙江新丰(中友)有限公司］，生化培养箱SPX-150A/B（杭州绿博仪器有限公司），紫外可见分光光度计Alpha1900（上海谱元仪器有限公司）。

1.3 方法：分述如下。

1.3.1 乌梅提取液的制备：将乌梅去核，室温干燥，加200ml蒸馏水煮沸2h,提取液过滤，在旋转蒸发仪内蒸发制备成1g/ml溶液，－20℃冰箱保存备用，用前摇匀，并稀释到相应浓度使用。

1.3.2 细菌培养：变形链球菌菌株经复苏后接种于马血琼脂（HBA）培养基，在厌氧箱37℃下培养48h，收集细菌并在牛脑心浸液（BHI）制成浓度为107～108CFU/ml的菌悬液备用。

1.3.3 抗菌活性的研究：将20μl菌悬液接种于HBA培养皿，涂布均匀。用20μl不同浓度的乌梅提取液浸润直径6mm纸片，将其呈同心圆分布均匀放置于HBA培养皿，与培养基完全接触；同时用10μl的0.2%（w/v）洗必泰作为阳性对照。HBA培养皿在37℃厌氧箱培养48h，肉眼观察有无抑菌圈，用游标卡尺量取抑菌圈的直径，计算平均抑菌圈直径。

1.3.4 最低抑菌浓度（MIC）及最低杀菌浓度（MBC）的测定：将乌梅提取液和液体培养基进行对倍稀释，质量浓度分别为1000mg/ml、500mg/ml、250mg/ml、125mg/ml、62.5mg/ml、31.25mg/ml、15.6mg/ml。各试管加入菌悬液50μl，37℃厌氧培养48h，取出肉眼观察，无肉眼可见菌生长试管对应的加入乌梅提取液最低浓度即为MIC。MBC是根据MIC的测定结果，选取MIC、2×MIC和4×MIC对应浓度样品的菌液20μl，点植于HBA培养基上，厌氧培养48h后观察，不生长菌落对应的最低药物浓度即为MBC。

1.3.5 乌梅提取液对完整牙体细菌生物膜的影响：离体完整前磨牙清洁、高温高压灭菌后备用。在试管内以1%蔗糖调节BHI菌液浓度到106CFU/ml，将牙体置于试管内，37℃厌氧培养48h，待牙体细菌生物膜形成后，用无菌PBS洗涤2次以去除游离细菌。以不同浓度乌梅提取液（500mg/ml、250mg/ml、125mg/ml）分别加入含3ml BHI培养基的试管，静止作用5min，以0.2%洗必泰和BHI分别为阳性和阴性对照。然后去除管内液体并用PBS溶液洗涤2次。用含MTT的BHI溶液2ml浸泡，37℃培养4h，加入DMSO溶解，将每种溶液转移到新的96孔板中并在光谱仪中于490nm读取吸光度。

1.4 统计学分析：试验数据以均数±标准差表示。采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析和处理，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 抑菌活性的研究：见表1。

表1 乌梅提取液对变形链球菌的抑菌圈直径(±s，mm)

表1 乌梅提取液对变形链球菌的抑菌圈直径(±s，mm)

注：与阴性对照组比较，*P＜0.05。

抑菌直径0 14.24±0.2*11.87±0.3*9.68±0.1*9.21±0.3*组别阴性对照组试验组1（1000mg/ml）试验组2（500mg/ml）试验组3（250mg/ml）阳性对照组（0.2%洗必泰）

2.2 MIC及MBC：见表2。

表2 乌梅提取液对变形链球菌的MIC及MBC

2.3 对完整牙体细菌生物膜的影响：见表3。

表3 乌梅提取液对变形链球菌牙体细菌生物膜形成的影响(±s)

表3 乌梅提取液对变形链球菌牙体细菌生物膜形成的影响(±s)

注：与阴性对照组比较，*P＜0.05。

组别阴性对照组试验组1（500mg/ml）试验组2（250mg/ml）试验组3（125mg/ml）阳性对照组（0.2%洗必泰）OD值2.378±0.354 1.352±0.272*1.499±0.315*1.689±0.457*1.288±0.331*

3 讨论

早期的研究已经发现乌梅果肉的主要成分为有机酸、萜类、甾醇、氨基类、糖类、挥发性成分、脂类、黄酮类、生物碱、微量元素等。乌梅是一种安全性高的药食同源药材，其药理作用广泛[3]。已有研究证实乌梅及其炮制品乌梅肉、乌梅炭对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌有不同程度的抑菌作用[4]。更深入的研究表明针对于李斯特菌来说，乌梅提取液通过破坏细菌的细胞膜系统和阻滞DNA的合成抑制其生长繁殖[5]。同时，乌梅提取液对嗜酸乳杆菌、牙龈链球菌、变形链球菌、念珠菌等15种口腔致病菌都有抑制作用[6]。国内也有学者通过薄层色谱-生物自显影技术以及高效液相色谱法对其主要抑菌成分进行分析，初步确定乌梅醇提物中起主要抑菌作用的是有机酸类，而其中含量最高的是柠檬酸。因此，推测柠檬酸是乌梅中主要的抑菌活性物质之一，但是否还有其他成分发挥抑菌活性有待进一步深入研究[7]。

变形链球菌被公认为是最主要的致龋菌，由该类病原体形成的牙菌斑生物膜与龋病的发生有密切的关系。与浮游菌相比，菌斑生物膜内细菌的毒力、耐药性和抵抗宿主免疫防御的能力更强[8]。本研究检测了乌梅水提取液对变形链球菌的抑菌活性，发现其对该菌的MIC为50mg/ml，MBC为100mg/ml。研究还比较了乌梅水提取液对变形链球菌在完整牙体形成细菌生物膜的影响，发现在乌梅水提取液的干扰下，变形链球菌在牙体组织形成细菌生物膜的能力被极大地削弱。这表明乌梅水提取液在治疗口腔变形链球菌及防治龋齿方面具有一定优势。

本试验仅对乌梅水提取液进行抑菌活性分析，尚未开展其他溶剂萃取相的抑菌活性分析，其活性成分有待进一步分析鉴定。本研究可为乌梅在口腔疾病防治中的综合利用提供数据支持。