艾炷灸命门穴对衰老模型大鼠脑组织中AGEs、RAGE表达影响*

蒋云芳，赵彩娇，韦日铺，黄逸珠，卢美静

(广西中医药大学，广西 南宁 530001)

人口老龄化是个日益严峻的社会问题，许多与衰老早期相关的疾病如心脏病、高血压、脑梗塞等心血管疾病及阿尔茨海默、帕金森等神经退行性变疾病的发病率在逐年增长，这些与增龄相关的疾病不仅会加速衰老的进程，也使老年人的生活质量严重下降，给家庭与社会带来极大的负担。晚期糖基化终末产物(Advance dglycation end products，AGEs)是体内生物大分子(蛋白、核酸等)与糖非酶促反应的最终产物，它的存在与衰老及衰老早期疾病有着密切联系，是衰老的重要生物学标志[1]。艾灸疗法具有操作简便、安全可靠、效果显著、无或少副作用、费用经济等优势，查阅古今文献可知艾灸的干预能够延缓衰老，但其延缓衰老的机制有待于进一步的实验研究。故本实验以D-半乳糖致大鼠衰老模型为研究对象，选取命门穴进行艾炷灸干预，应用现代医学的蛋白组学技术检测，观察大鼠脑组织中AGES、受体RAGE及RAGE mRNA表达水平影响，探讨艾炷灸延缓衰老的机制，进一步为艾炷灸命门穴延缓衰老提供实验依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物

本实验采用健康SD雄性大鼠共40 只，月龄在42～49天，体质量200～250 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证编号为：SCXK(湘)2016-0002。将所有大鼠放在每天光照与黑暗各12 h(光照时间为7:00—19:00)、室温18～22℃的实验室条件下，进行饲养，实验期间给大鼠自由进食和自由饮水。在实验的过程中，遵照国家科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的要求对动物进行处置。

1.2 实验药品与试剂

D-半乳糖(Sigma公司)；膜蛋白、核蛋白和胞质蛋白抽提试剂盒(上海生工，Cat. C510002)；Rat Advanced Glycation End Products (AGEs) ELISA Kit(武汉华美生物工程有限公司)；Rat advanced glycosylation end product-specific receptor (AGER)ELISA Kit(武汉华美生物工程有限公司)；艾炷采用艾绒(丰阳艾条公司)制成，制作方法：将艾绒捻成直径约3 mm、高6 mm的艾炷，每个艾炷称为1壮，质量约30 mg/壮。

1.3 主要实验仪器

Centrifuge 5810R离心机(德国 Eppendorf 公司)；MDF-H73865 医用低温箱(-80℃)(日本三洋电机株式会社)；BCD-210DCM 冰箱(青岛海尔股份有限公司)；TissueLyser LT匀浆仪(Qiagen，GER)；微量移液器(德国 Eppendorf 公司产品)；SW-CJ-IFD 洁净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司产品)；DHG-9140A 电热恒温鼓风干燥箱(海鸿都电子科技有限公司产品)；FA2204B电子秤(上海精科天美科学仪器有限公司产品)。

1.4 动物分组

将所有健康雄性SD大鼠(共40只)进行适应性喂养1周，1周后随机分组，其中A组(空白组)10只、剩余30只大鼠均用于制备衰老模型，模型制备成功后随机选取20只大鼠分为B组(模型对照组)、C组(命门穴治疗组),每组各10只。

1.5 衰老大鼠模型的建立

大鼠造模参照崔氏[2]造模的方法，模型制备组采用D-半乳糖溶液(按照1g D-半乳糖加入10 mL生理盐水的比例配备D-半乳糖溶液，现配现用)进行腹腔注射造模，每天注射1次，注射剂量参照大鼠的体重而定，标准为500 mg/kg。连续造模60天后，若大鼠出现明显的亚急性衰老症状，如精神萎靡不振、进食减少、肢体温度偏低、形体趋向于臃肿、行动反应迟缓、皮肤松弛缺乏弹性、毛色枯黄无泽等,提示模型制备成功。

1.6 处理方法

1.6.1 A组(空白组) 每日空腹称体质量，腹腔注射同体积生理盐水，每日1次，连续60天。

1.6.2 模型制备大鼠 每日空腹称体质量，秤质量后进行腹腔注射制备成亚急性衰老模型。模型制备成功后随机选取20只大鼠分为B组(模型对照组)、C组(命门穴治疗组),每组各10只。

1.6.3 造模后处置 A组(空白组)：继续正常喂养，不作其他处理。B组(模型对照组)：继续正常喂养，不作其他处理。C组(命门穴治疗组)：采用艾炷灸命门穴进行干预，实验者一人左手拇指和食指抓住大鼠颈部皮肤，使大鼠呈俯卧位，右手固定大鼠一边大腿及尾部，另一人固定另一边大腿并进行治疗操作，命门穴的定位参照黄氏选穴方法[3]选取。施灸前先剪去施灸部位的体毛，然后再用少量芦荟汁涂抹，将艾炷安放固定好后，用线香点燃艾炷进行无瘢痕直接灸，当大鼠出现肢体扭动、剧烈挣扎时迅速用镊子移走艾炷，每次连续灸3壮，每日1次，共4周。

1.7 标本采集

各组大鼠水迷宫结束后第2天开始采集标本，采集标本前禁食12 h，大鼠麻醉后处死立即于冰台上快速取脑组织，用匀浆仪制备脑匀浆，放入-80℃冰箱贮存。

1.8 观察指标测定

1.8.1 大鼠行为学检测 全部组在治疗结束后第1天开始采用Morris水迷宫检测法[4]进行水迷宫测试。检测前先在水池中放置平台，平台置于某一象限的中间，然后往池中注入清水，至水面高出平台2 cm为止，水温控制在(21.0±1.5)℃左右，将大鼠面向池壁放入水中，4个象限中的任一象限均可作为入水点，4个象限依次放入，大鼠在水中游泳时会主动寻找并爬上平台，其所需的时间即称为潜伏期，观察并记录潜伏期的时间长短作为学习记忆能力的指标。将大鼠每次入水的最长游泳时限设定为60 s，如果大鼠在60 s内未能在水中找到平台则将潜伏期记为60 s，这时需将其引至平台并停留10 s，以强化大鼠对平台的记忆能力，每天训练1次，在经过连续5天的训练后于第6天撤除平台，将大鼠放入水中游泳，入水点同上，观察记录120 s内大鼠跨越平台相应位置的次数，数值越高说明其空间探索能力越强。

1.8.2 酶联免疫吸附测定法 测定大鼠脑组织匀浆中晚期糖基化终末产物(AGEs)、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)，采用双抗体夹心法测定。严格按照试剂盒说明书执行。

1.8.3 RT-PCR 测定脑组织中RAGE mRNA：使用RNAprep pure Tissue Kit 提取组织总RNA，FastQuant cDNA第一链合成预混Mix合成第一链cDNA，严格按照试剂盒执行，目的基因RAGE与内参基因β-actin的引物序列为：Forward Primer(5′→3′)CCCAATGGTTCACTCCTCCTT，Reverse Primer(5′→3′)CACCGGAAAGTCCCCTCAT；每个PCR反应体系包括：2×12.5 μlTalent qPCR PreMix 、上、下游引物各0.75 μL、1 μLcDNA、11 μLddH2O ，采用相对定量ΔΔCT法，PCR反应条件：95℃预变性15 s，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸32 s，40个循环；PCR反应结束后绘制熔解曲线。

1.9 统计方法

2 实验结果

2.1 各组大鼠行为学的表达情况

结果显示,模型对照组与空白组比较，模型对照组比空白组大鼠找到平台的潜伏期时间延长，穿越平台的次数减少,两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。命门穴治疗组与模型对照组比较，命门穴治疗组大鼠找到平台的潜伏期时间减少、穿越平台的次数增多，差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。见表1～2。

表1 水迷宫实验中各组大鼠定位航行潜伏期比较

注：与空白组比较，※P<0.05，※※P<0.01；与模型对照组比较，★P<0.05，★★P<0.01。

表2 水迷宫实验中各组大鼠空间探索能力情况

注：与空白组比较，※P<0.05，※※P<0.01；与模型对照组比较，★P<0.05，★★P<0.01。

2.2 大鼠脑组织中AGEs、RAGE表达情况

结果可知,模型对照组与空白组相比，模型对照组大鼠脑组织匀浆中AGEs、RAGE表达水平明显升高，两者比较差异具有统计学意义(P<0.01)；命门穴治疗组和模型对照组比较，命门穴治疗组大鼠脑组织匀浆中AGEs、RAGE表达水平明显下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠脑组织中AGEs、RAGE表达情况

注：与空白组比较，※P<0.05，※※P<0.01；与模型对照组比较，★P<0.05，★★P<0.01。

2.3 大鼠脑组织中RAGE mRNA表达情况

结果可知，模型对照组与空白组相比，模型对照组大鼠脑组织匀浆中RAGE mRNA表达水平明显升高，两者比较差异具有统计学意义(P<0.01)；命门穴治疗组和模型对照组比较，命门穴治疗组大鼠脑组织匀浆中RAGE mRNA表达水平明显下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表4。

表4 各组大鼠脑组织中RAGE mRNA表达情况

注：与空白组比较，※P<0.05，※※P<0.01；与模型对照组比较，★P<0.05，★★P<0.01。

3 讨论

艾灸作为中医学的重要组成部分，在延缓衰老、防病保健中发挥着重要的作用。命门穴是艾灸延衰保健最重要的穴位之一，其位于第2腰椎棘突下凹陷处；命门中的命即指生命，门则指出入通达之处，故命门穴寓含的意思是生命本源的动力出入通达与维系生命的地方。命门与肾有密切的联系，《针灸问答·奇经八脉解说》曰:“再上十四椎，当肾正中，为命门穴，乃肾系着脊之处，为督脉之主。”《勉学堂针灸集成 》中记载命门穴主治“脑虚,旋仆,善忘……”。即说明命门穴有防治脑衰老的作用。命门是对能调控五脏机能的先天精气的概括，而命门穴是命门在人体体表的门户，通过艾灸刺激命门穴能激发先天元气，温煦命门相火[5]。《难经·第三十六难》谓:“肾两者，皆非肾……右者为命门。”命门是生命之原，是精神之所舍,原气之所系，是男子藏精、女子系胞之处。明代张介宾曰:“命门为元气之根,水火之宅,五脏之阴气非此不能滋,五脏之阳气非此不能发。”赵献可也认为命门之火是十二官的功能活动的原动力。综合以上医家的论述研究可知命门之火是生命的原动力，“命门火衰”即是衰老的主要原因，而通过艾灸命门穴，能够温阳助火，鼓动肾间之动气，化生气血而温煦滋养全身，延缓衰老[6]。张燕等在基因调控层次上研究艾灸命门穴对炎性衰老的影响，发现22条与衰老相关的炎性反应基因,在艾灸命门穴后，有19条基因的表达在治疗后总体趋向正常，说明艾灸命门穴能调控炎性基因表达而起到抑制衰老的作用[7]。这也是本实验选用命门穴作为干预手段的依据。

AGEs与衰老及衰老早期疾病有着密切的联系，在生理条件下，人体体内生物大分子与还原糖在无酶条件下进行无酶缩合反应，最终形成稳定不可逆交联体，即晚期糖基化终产物(AGEs)[8]。AGEs可随着年龄的增长在人体各组织器官不断堆积，导致细胞组织器官的不断损伤，最终加速衰老的形成[9]；研究证明[10]AGEs与衰老及糖尿病、动脉硬化、阿尔茨海默病、白内障等增龄性疾病有着密切的关系；而D-半乳糖作为还原糖中的醛糖，长期注射可以产生大量的AGEs，如郭妍等[11]在实验中发现,D-半乳糖衰老模型与自然衰老大鼠心肌内AGEs含量均高于成年对照组。熊爱华等[12]也证实D-半乳糖衰老模型的脑组织中会产生大量的AGEs,可降低脑组织中抗氧化能力及引起胞质[Ca2+]超负荷，出现脑细胞内线粒体的损伤引起衰老。由此可推测D-半乳糖所致衰老模型从AGEs的生成方面是有别于其他衰老模型的。如本研究中模型对照组大鼠脑组织中AGEs表达增加，此结论与上述情况相符。

AGEs的致病途径分为直接与间接两个方面，AGEs可直接修饰蛋白质，破坏细胞原有的结构和功能，导致机体损伤,加速机体衰老进程；也可通过与存在于细胞表面的特异性受体RAGE相互作用，引发一系列的生物学效应而致衰老[13]。RAGE作为AGEs最重要的受体，AGEs的许多功能是通过与位于细胞表面的特异性受体RAGE相互作用所致[14]。AGEs与细胞表面的RAGE结合后，可生成大量的氧自由基，激活炎症开关转录因子NF-kB，使NF-kB核内移，介导NF-kB炎症通路，并诱导产生多种损伤因子，导致细胞的功能和结构的异常，引起机体损伤，导致衰老加速[15]。AGEs需要受体RAGE降解，故AGEs的大量产生能诱导RAGE表达水平的上调，本研究结果显示,模型对照组大鼠脑组织中的RAGE及RAGE mRNA表达较空白组水平升高。

因此，本实验采用D-半乳糖致衰老模型大鼠作为研究对象，选取命门穴进行艾炷灸干预，观察大鼠脑组织中AGES、RAGE及RAGE mRNA表达水平影响，实验结果显示艾炷灸命门穴可以下调D-半乳糖衰老模型大鼠脑组织中上述指标的表达水平，说明艾炷灸命门穴可以延缓衰老，其机制可能是AGEs的水平下调减少了对蛋白的直接修饰及抑制AGEs与特异性配体RAGE结合而引发一系列的生物学效应而达到延缓衰老的目的。

衰老常伴有学习及记忆力下降等表现，因此在检测大鼠脑组织中的指标前采用Morris 水迷宫实验评价衰老大鼠学习及空间记忆能力，本研究结果显示,D-半乳糖致衰老大鼠会出现记忆力减退和空间认知障碍，而命门穴治疗组较模型对照组大鼠找到平台的潜伏期时间减少，穿越平台的次数增多，说明艾炷灸命门可以改善D-半乳糖衰老大鼠的学习及空间记忆力。

衰老的机制是多方面、多层次的，AGEs与衰老的关系早已被证实，而本实验研究首次验证艾炷灸命门穴可以下调AGEs表达水平来延缓衰老，不仅为艾炷灸延缓衰老提供了实验依据，也提示了AGEs与多种增龄相关性疾病密切相关，那么艾炷灸命门穴是否也能减少相关增龄性疾病的发生及发展,例如防治糖尿病、动脉硬化等,这有待于进一步的研究论证。