电针对帕金森抑郁模型大鼠脑内单胺类神经递质含量影响研究

于建军

(黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040)

帕金森病(PD)是一种与遗传、环境、神经系统老化等因素相关的常见的神经退行性疾病。临床表现有静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势平衡障碍等特征性运动症状，亦有精神障碍、便秘、嗅觉障碍、睡眠障碍等非运动伴随症状。其中精神障碍中的抑郁症状对患者生活质量的影响比运动障碍更为严重。目前普遍认为40%～50%的PD患者合并抑郁[1]。抑郁症状会影响患者的治疗效果，加重患者运动障碍，加重残疾率,降低生活质量。但帕金森抑郁(PDD)与原发性抑郁的发病机制、临床表现、对抗抑郁药的反应不完全相同。PDD的发病机制尚不清楚，主流认为与内源性生物学改变及外源性环境因素有关。本研究观察电针刺激法对PDD模型大鼠脑内单胺递质多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)含量的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SD大鼠120只，雌雄不拘，大鼠平均体质量为(258.12±36.14)g，购入后在实验室中饲养7天(保证每天12 h光照以及大鼠的正常饮水与摄食，保持清洁的饲养环境)，待大鼠适应新环境、状态佳后开始实验。

1.2 主要仪器及试剂

DA放免试剂盒、5-HT放免试剂盒、NE放免试剂盒(解放军总医院东亚免疫技术研究所)；0.25 mm×25 mm针灸针(贵州安迪药械有限公司,安迪牌)；G6805-2A型电针治疗仪(上海华谊仪器制造厂)。

1.3 造模方法

1.3.1 PD大鼠造模方法 对56只大鼠进行编号，随机抽出12只做为空白组，剩余的44只均用于造模实验。对造模组大鼠称体重计算麻醉药用量，采用常规方法麻醉，大鼠麻醉成功后利用脑立体定位仪获取大鼠脑立体定向图谱，确定大脑黑质区位置后，钻开颅骨，注射器确定靶向位后缓慢注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)。在术后2周，在大鼠腹腔注射阿扑吗啡诱发大鼠旋转，计数40 min内的旋转次数。记录大鼠5 min向健侧旋转的次数以及在40 min之内发生旋转的总次数[2]。而后对结果进行计算处理，每分钟向健侧旋转次数大于7圈，且在40 min内旋转次数大于280圈的大鼠认为是阳性大鼠，连续4周进行统分析，每周结果均符合上述要求的大鼠即为PD模型鼠。在本次造模试验中44只大鼠中共36只大鼠造模成功。

1.3.2 PDD模型制作 待PD模型造模成功后，随机抽出12只做为6-OHDA模型组，其余24只大鼠利用改进版的Winner慢性不可预见温和应激法结合孤养法制造大鼠抑郁模型[3]。首先将用于造模的实验大鼠单独1个鼠笼饲养，而后通过不定顺序的刺激导致大鼠出现应激障碍，其刺激条件包括全天禁食、全天禁水、4℃冷水游泳、悬尾、昼夜颠倒、行为限制以及电击足底7种应激刺激，整个刺激周期为21天，每种刺激出现3～4次，但是保证1个刺激不能连续出现两天，观察大鼠的行为学变化并进行评价。

1.4 分组与处理方法

56只大鼠中随机抽出12只做为空白组，在第1次造模成功的36只大鼠中随机抽出12只做为6-OHDA模型组，将2次造模的24只大鼠分为2组:6-OHDA抑郁模型组12只、电针组12只。

电针组选用“百会”“印堂”“太冲”“三阴交”穴。根据实验动物针灸穴位图谱定位，“百会”透刺“印堂”穴，“印堂”穴向下平刺，“太冲”“三阴交”直刺进针，深度为8～10 mm，“百会”与“印堂”“太冲”与“三阴交”接G-66805型电针治疗仪，设置电流强度为0.6 mA，频率为2 Hz，待大鼠头部和脚趾发生微颤定为针刺程度上限，电针时间为40 min，每日1次。治疗周期为8周，从第5周开始观察大鼠的行为学变化。其余3组不给予任何处置。

1.5 观察指标与评价方法

1.5.1 动物行为学观察指标与评价方法 评价方法主要包括悬尾试验、糖水偏爱实验以及强迫游泳实验。其具体的评价方法[4]为:①悬尾试验(Tail suspension test,TST)：大鼠尾巴固定于悬空横杆上，保持大鼠与地面1.5 m高度，统计大鼠在每5 min内的静止时间，大鼠四肢与头部相对不动，整个身体晃动的时间划分到静止时间。②糖水偏爱实验(Sucrose preference test,SPT)：大鼠分笼后，在每个鼠笼中放置两个饮水装置，在实验开始的第1天，在两个容器中均放入含量为1%的蔗糖溶液，在实验第2天，将其中1个容器中的蔗糖水更换成纯净水。而后禁食水1天，开始糖水消耗实验检测，同时给予大鼠等量的1%的蔗糖溶液以及纯净水，正常饲喂24 h后，计算糖水的消耗量，从而确定大鼠的糖水偏爱率，其计算公式为：糖水偏爱率=糖水消耗/综合体消耗×100%。③强迫游泳实验(Forced swimming test,FST)：在透明的玻璃缸中放置温度23～25℃的温水，放入实验大鼠进行强迫游泳实验，游泳时长为6 min，前两分钟由于大鼠刚接触水环境的一系列应激性行为不计入统计，记录后4 min大鼠漂浮不动的时间，大鼠静止时间越长说明抑郁程度越大。在每只大鼠完成试验后要对实验用具进行统一的清理，避免影响下一只大鼠的检测结果。

1.5.2 神经递质检测方法 大鼠行为学检测实验完成后，将大鼠麻醉处死，快速取出大鼠脑组织，将其进行保存。适时取冷冻保存的脑组织，制备脑组织匀浆样本，4℃13 000 r/min 离心处理20 min后取上清液利用放射免疫测定方法检测。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠行为学比较

与空白组比较，6-OHDA抑郁模型组大鼠的悬尾静止时间与悬浮不动时间明显延长，糖水消耗率明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，说明6-OHDA抑郁模型组大鼠出现了行动缓慢、反应迟钝、精神萎靡等抑郁表现。6-OHDA抑郁模型组与6-OHDA模型组各指标比较，差异无统计学意义(P>0.05)。电针组与6-OHDA抑郁模型组相比，大鼠悬尾静止时间及悬浮不动时间缩短，糖水消耗率升高，差异有统计学意义(P<0.05)，说明电针对帕金森抑郁大鼠的行为学有良好的改善作用。见表1。

表1 各组大鼠行为学比较

注：与空白组比较，△P<0.05；与6-OHDA模型组比较，*P>0.05；与6-OHDA抑郁模型组比较，#P<0.05。

2.2 大鼠脑内DA含量变化

与空白组比较，6-OHDA模型组与6-OHDA抑郁模型组大鼠脑内DA含量均显著降低(P<0.05)，结合行为学表现说明帕金森模型造模成功。6-OHDA模型组与6-OHDA抑郁模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。电针组与6-OHDA抑郁模型组比较，大鼠脑组织中DA含量升高，经检验差异有统计学意义(P<0.05)，说明电针可使帕金森抑郁模型大鼠脑内的多巴胺含量升高。见表2。

表2 大鼠脑内DA含量变化

注：与空白组比较，△P<0.05；与6-OHDA模型组比较，*P>0.05；与6-OHDA抑郁模型组比较，#P<0.05。

2.3 大鼠脑内5-HT与NE含量变化

与空白组比较， 6-OHDA模型组、6-OHDA抑郁模型组大鼠脑内5-HT与NE含量均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与6-OHDA模型组比较，6-OHDA抑郁模型组大鼠脑内5-HT与NE含量均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，说明帕金森抑郁与5-HT与NE含量降低有相关性。与6-OHDA抑郁模型组比较，电针组大鼠脑组织中5-HT与NE含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)，说明电针法可以提高帕金森病抑郁大鼠脑5-HT与NE的含量。见表3。

表3 大鼠脑内5-HT与NE含量变化

注：与空白组比较，△P<0.05；与6-OHDA模型组比较，*P<0.05；与6-OHDA抑郁模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

PDD是PD患者常伴发的非运动症状,以显著而持久的心境低落为主要临床特征，有闷闷不乐、悲痛欲绝、自卑、悲观厌世等情绪症状，严重者有幻觉、妄想等精神症状，因此可出现思维迟缓、缺乏主动性等表现。本研究的研究对象为无沟通能力的大鼠，因此无法表达自己的情绪与精神状态，选择慢性不可预见温和应激(CUMS)法造模，因为刺激的不可预见性和多变性使之比较现实的模拟人在生活中所遭遇的各种困难。并且经过长期多变和不可预见温和应激之后，大鼠糖水消耗量的减少反映了抑郁的核心症状——对奖赏的反应性下降，即快感缺失[5]。模型引发的抑郁样行为可持续数月,长期服用抗抑郁药物可纠正并改善这些异常行为,是目前使用最为广泛的模型[6]。

单胺类神经递质属于中枢神经递质，对神经、内分泌等系统有非常广泛的调节作用，并对情感、情绪、应激行为等生理活动产生重要影响。其主要包括5-羟色胺(serotonin，5-HT)和儿茶酚胺(CA)。儿茶酚胺主要指多巴胺(Dopandne，DA)、肾上腺素(Adrenaline，A)和去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)[7]。在中枢神经系统中，5-HT、NE、DA 之间联系紧密并且相互作用，三者的平衡失调是引起抑郁症的重要原因[8]。5-HT是临床上目前治疗抑郁症的重要靶向因子。脑内5-HT系统的功能异常与抑郁症的发病密切相关[9]。NE具有调节机体情绪、认知等生理功能。有研究表明NE通过去甲肾上腺素转运体(Norepinephrine transporter，NET)的微调而发挥作用，在抑郁症的发病中可能起着重要作用[10]。DA 作为NE的前体，参与心理应激活动及精神情绪活动，脑内DA含量降低时就会出现情绪抑郁。

PDD在中医理论中属于“颤证”“郁证”合病的一种疾病类型，该病肝肾阴亏为本，风、火、痰、瘀为标，导致髓海空虚、气机郁滞，是本病产生的根本原因。王顺教授通过30年针灸临床与科研实践，独出机杼地提出“调神畅情三六九针法”[11-15]。调神畅情最早见于《北堂书钞·卷一四二》曰:“安虑润气，调神畅情”，但书中未有详载。王教授解释为使精神顺适、情绪欢畅。因在动物实验过程中，考虑到针刺部位存在的局限性，故在“调神畅情三六九针法”中选取典型代表穴位进行针刺，百会为诸经交会之要穴，又为督脉之大穴，“督脉入络脑”与脑关系密切，所以人体之精气可以通过百会散络于脑。调节百会穴，可奉养元神，有健脑益髓、益心安神之功。印堂穴位于脑海前庭，为经外奇穴，有安神定惊、醒脑开窍、宁心益智、疏风止痛、通经活络之功。太冲为足厥阴肝经输穴、原穴，具有疏肝理气、通经活络、平肝熄风、清热利湿之效。三阴交为足太阴脾经腧穴，为肝脾肾三经的交会穴，有补脾益肾调肝之功效。四穴相配，标本兼治，加强了醒神复常、健脑宁心、安神定志的功效。

本研究结果证实，与空白组大鼠相比,6-OHDA模型组与6-OHDA抑郁模型组大鼠脑内DA含量均显著降低(P<0.05)，结合行为学表现说明PD模型造模成功。6-OHDA抑郁模型组大鼠出现了行动迟缓、对事物兴趣下降等变化，但电针刺激后，其悬尾静止时间以及强迫游泳悬浮时间显著缩短，且糖水消耗率升高，说明电针法能够有效的缓解大鼠抑郁相关的行为学活动。与空白组、6-OHDA模型组相比，6-OHDA抑郁模型组大鼠脑内5-HT与NE含量均显著降低(P<0.05)，说明PDD与5-HT和NE含量降低有相关性。这一结果与之前相关研究所证实的抑郁症发病与5-HT以及NE等神经递质的含量异常之间存在紧密联系[16]的结果相符合。与6-OHDA抑郁模型组相比电针组大鼠脑组织中5-HT与NE含量升高，说明电针法可以提高PDD大鼠脑内5-HT与NE的含量。

综上，电针可使PD大鼠脑内DA含量显著升高、PDD大鼠脑内5-HT与NE水平明显升高，从而改善抑郁症状，值得在临床中推广。