LAMP技术检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因L858R位点突变方法的建立及应用

钮 静， 权文强， 李 冬

（1.上海市宝山区中西医结合医院检验科，上海 210900；2.同济大学附属同济医院检验科，上海 200065）

靶向治疗是目前非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）主要的治疗手段[1]。有研究发现，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）在NSCLC靶向治疗中具有重要作用，其酪氨酸激酶编码区基因突变是靶向药物发挥作用的必要前提条件[2-4]。因此，进行EGFR基因突变检测在肺癌的靶向治疗中显得尤为重要。但目前用于EGFR基因突变检测的方法操作复杂、检测周期长，且实验对象多为组织标本，阻碍了EGFR基因突变检测在临床的应用。因此，临床需要建立更加简单、快速、准确、经济的检测方法。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术是近年来兴起的快速核酸扩增技术，主要利用2对或3对特异性引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下连续高效扩增，具有很高的特异性和敏感性。LAMP技术操作简单，在普通恒温设备中就能完成扩增，可肉眼直接判读结果，非常适合核酸的快速检测[5-6]。目前，LAMP技术已被广泛用于临床疾病的诊断、病原微生物的定性检测、基因芯片开发等领域。本研究拟建立一种采用LAMP技术快速检测NSCLC患者EGFR基因21号外显子L858R位点突变的即时检测（point-of-care testing，POCT）新方法。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2017年上海市胸科医院收治的11例NSCLC患者血浆标本，所有患者均排除肺部炎症性疾病、合并其他原发肿瘤，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测结果均为EGFR L858R突变阳性。另收集2017年上海市宝山区中西医结合医院9名体检健康者血浆标本；含有L858R突变的细胞株H1975和野生型细胞株A549购自中国科学院上海生命科学研究院。

1.2 仪器与试剂

LA-500环介导等温扩增实时浊度仪（日本荣研公司），干式恒温器（杭州奥盛仪器有限公司），微流控芯片由中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所制作。细胞DNA提取试剂盒和磁珠法血浆游离DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]，钙黄绿素（日本荣研公司），Bst DNA聚合酶（美国NEB公司）。

1.3 方法

1.3.1 LAMP引物设计 在Genebank上查找EGFR基因21号外显子的DNA序列，查阅相关文献确定含有EGFR L858R突变位点的序列位置，利用在线引物设计软件Primer Explorer V4上传目的基因序列，设计LAMP反应的4条引物F3、B3、FIP、BIP，同时为了增加LAMP反应的特异性，针对突变位点设计了可形成发卡结构的引物P-M及封闭探针PNA-W，F3、B3、FIP、BIP、PNA-W、P-M引物序列分别为5'-GCAGCCAGGAACGTACTG-3'、5'-ACAGCTAGTGGGAAGGCAG-3'、5'-TCTCTTCCGCACCCAGCAGTCACCGCAGCATGTCAAGA-3'、5'-ACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTCCCTGGTGTCAGGAAAATGC-3'、5'-TTGGCCAGCCCAAAATCTGTG-3'、5'-CACAGATTTTGGCCCGCCCAAAATCTGTG-3'。EGFR L858R为野生型，封闭探针PNA-W与之结合起到封闭作用，P-M无法与靶序列结合，抑制DNA扩增；EGFR L858R为突变型时，封闭探针PNA-W无法结合，不能起到封闭作用，P-M与靶序列结合，促进DNA扩增。扩增原理见图1。

图1 LAMP扩增原理

1.3.2 样本处理 采用细胞DNA提取试剂盒提取细胞株A549、H1975经培养收集后的DNA。采用血浆游离DNA提取试剂盒提取11例NSCLC患者血浆和9名体检健康者血浆cft DNA。

1.3.3 L A M P 反 应 体 系 的 建 立 L A M P 反应体系包括：2.5 μL缓冲液、1 μL Bst DNA聚合酶（8 000 U/mL）、1.5 μL MgSO4（100 mmol/L）、3.5 μL dNTPs（10 mmol/L）、1 μL F3（5 μmol/L）、1 μL B3（5 μmol/L）、1 μL FIP（40 μmol/L）、1 μL BIP（40 μmol/L）、1 μL P-M（40 μmol/L）、1 μL PNA-W（40 μmol/L）、1 μL 钙黄绿素、7.5 μL去离子水、2 μL模板DNA，采用干式恒温器63℃条件下扩增60 min，采用荧光目测和2%琼脂糖凝胶电泳判读扩增结果。

1.3.4 LAMP结果的判读 选用钙黄绿素作为荧光指示剂，根据反应结束后是否有肉眼可见的绿色荧光判断结果：出现绿色荧光为阳性，没有颜色变化为阴性。另取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以验证荧光目测结果的准确性。阳性扩增产物电泳条带为连续梯状特异性条带。

1.3.5 LAMP敏感性验证 用含相同拷贝数的A549 DNA溶液梯度稀释H1975 DNA溶液，配置成含有突变负荷分别为100%、10%、1%、0.1%、0.01%的标准液。通过检测标准品来分析所建立的LAMP方法的敏感性。

1.3.6 LAMP特异性验证 检测9名体检健康者血浆循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），以细胞株H1975 DNA为阳性对照，A549 DNA为阴性对照，分析所建立的LAMP方法的特异性。

1.3.7 临床样本检测 采用数字PCR检测11例EGFR L858R突变阳性标本，以细胞株H1975 DNA为阳性对照，A549 DNA为阴性对照。通过与数字PCR结果进行比较来分析建立的LAMP方法的准确性。

1.3.8 LAMP与微流控芯片的结合 设计微流控芯片，委托中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所制作。采用微流控芯片结合LAMP检测细胞株H1975 DNA和A549 DNA，验证本研究设想的微流控芯片POCT平台的可行性。

2 结 果

2.1 LAMP方法的建立与结果判读

2.1.1 荧光目测结果 添加突变细胞株H1975 DNA模板的2号反应管中产生肉眼可见的绿色荧光，判读为LAMP扩增阳性。1号、3号反应管分别添加的是野生型细胞株A549 DNA和水，结果没有颜色变化，判读为LAMP扩增阴性。见图2（a）。

2.1.2 琼脂糖凝胶电泳 取干式恒温器扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。可见H1975细胞株DNA扩增产物出现了连续梯状特异性条带，判读为扩增阳性；A549细胞株DNA扩增产物因为引物浓度较高出现了引物二聚体，但未出现LAMP连续梯状特异性条带，判读为扩增阴性。见图2（b）。

图2 LAMP反应结果

2.2 LAMP敏感性验证

突变负荷依次为100%、10%、1%、0.1%的4个管（1、2、3、4号）内均出现绿色荧光，突变负荷为0.01%的管（5号）内没有颜色变化，见图3（a）。取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，含100%、10%、1%、0.1%突变负荷标准品的扩增产物出现了连续梯状特异性条带，含0.01%突变负荷的标准品的扩增产物没有出现特异性条带。荧光目测与琼脂糖凝胶电泳结果一致，本方法敏感性达到0.1%，见图3（b）。

图3 LAMP敏感性验证结果

2.3 LAMP特异性验证

9名体检健康者血浆标本中，采用LAMP法均未检测到EGFR L858R突变。本方法特异性达到100%。见图4。

图4 LAMP特异性验证

2.4 临床样本检测

11例数字PCR检测EGFR L858R突变阳性标本中，LAMP法检测到9例（9/11），另2例突变比例为0.31%和0.24%的突变阳性标本LAMP检测结果为阴性。见图5。

图5 突变阳性标本检测结果

2.5 微流控芯片检测结果

本研究制作的微流控芯片包括样本DNA入口（A）、反应液入口（B）、基因扩增及检测区（C）、废液池（D）。将LAMP反应液与样本DNA分别从A、B入口注入芯片，用石蜡油封闭出入口，放入恒温水浴箱63℃扩增60 min。结果显示，突变细胞株H1975 DNA出现绿色荧光，判定为扩增阳性，野生细胞株与水没有出现绿色荧光，判定为扩增阴性。见图6。

图6 微流控芯片检测结果

3 讨论

近年来，表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂 （epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）等靶向药物已经成为晚期NSCLC主要的治疗方法。国内外大量研究结果证实EGFR基因突变状态是患者是否对EGFR-TKI敏感的强预测因子[7-9]。采用靶向治疗前应做EGFR基因突变检测，根据突变情况选择靶向药物，进行个体化治疗。

目前，临床EGFR基因突变的检测仍以组织检查为首选[10]，但临床肿瘤组织获取难度较大，且大部分的NSCLC患者在确诊时已处于中晚期，错失了手术切除肿瘤的时机，无法获取肿瘤组织。以血液中的ctDNA为替代可以很好地解决获取组织标本的局限性。ctDNA是由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的游离核酸，与原发肿瘤的基因组DNA具有相同的遗传变异特征，能够特异性地反映肿瘤基因组的信息，且为无创操作，可以反复取材，因此在肿瘤的诊断、疗效监测及预后判断等方面具有显著优势。目前，用于检测血液ctNDA EGFR基因突变的方法较多，如突变扩增阻滞系统、数字PCR方法、分辨熔点曲线分析法、变性高效液相色谱技术、二代测序等[10-11]，但是这些方法操作较为复杂，对实验室条件及人员资质要求都很高，且需要特殊的检测设备，检测费用高，使得EGFR基因突变检测难以在医疗条件较差地区和经济负担能力不高的人群中普及。临床亟需准确且经济的检测平台与技术，使更多的NSCLC患者受益于靶向治疗。

本研究利用LAMP技术建立了血液EGFR L858R基因突变检测的方法。该方法不需要特殊检测设备，在干式恒温器中60 min就能完成扩增，选择钙黄绿素作为荧光指示剂，直接目测即可准确判读结果，操作简单、成本低廉。此外，本研究建立的LAMP法也具有较好的检测性能，针对含有L858R突变位点靶序列设计的LAMP引物及探针能够特异性地扩增突变型细胞株H1975 DNA，特异性达到100%，敏感性为0.1%。目前临床常用的突变扩增阻滞系统的检测敏感性为1%，数字PCR敏感性为0.1%，与临床常用方法相比，本研究建立的方法具有较高的敏感性。准确性方面，数字PCR检测阳性的11例标本，采用LAMP技术检测到9例阳性，有2例突变比例分别为0.31%和0.24%的标本检测结果为阴性，原因可能是临床样本检测时背景序列比较复杂，在样本突变比例较低时对本方法检测干扰较大。而数字PCR方法扩增前样本被平均分配到大量反应单元中，每个单元中靶基因以单分子状态呈现，背景序列对检测干扰小。此外，也可能与提取的ctDNA质量有关，血浆中ctDNA的含量很低，提取时游离DNA的降解和血液中细胞裂解释放出的基因组DNA都会影响突变检测。由于本研究中获得的临床样本有限，接下来还需要扩大样本量进一步进行方法学性能评价。我们利用LAMP技术建立的血液EGFR L858R基因突变检测方法简便、耗时短、特异性强、有较高的敏感性和准确性，适合临床NSCLC患者基因突变快速筛查，在基因突变检测领域有较大应用潜力。

微流控芯片技术打破了传统实验室空间、时间、仪器设备的限制，提供了一种小而全、高效率、低成本的新型检测技术平台，非常符合目前国内外医疗领域推行的POCT检测模式，应用前景非常好。本研究也尝试建立以微流控芯片为检测平台的POCT，在设计制作的芯片上我们实现了EGFR L858R突变模板的LAMP，可目测检测结果，基本实现了POCT。由于本研究时间的限制以及目前血浆ctDNA提取的复杂性，制作的芯片并没有整合样本的提取。在接下来的研究中我们将继续探索制作集样本提取、反应、检测于一体的微流控芯片，实现POCT模式的基因突变快速筛查，推动基因突变检测在基层医疗机构及经济不发达地区的普及，使更多的癌症患者受益于靶向治疗。