逆针灸对过敏性哮喘大鼠血清IL-2含量及肺组织GATA-3蛋白表达的影响*

华金双，邵素菊，王培育，张 君，何竹青，郑 洁，田 丽，徐 宁，胡晓京，杨京京

(河南中医药大学针灸推拿学院，河南 郑州 450046)

逆针灸是指在无病或者疾病即将发生之时，运用针刺或者艾灸的方法来提高机体的免疫力，从而防止疾病的发生，达到治未病作用的一种方法。课题组的前期研究表明[1-2]，逆针灸可以启动机体内源性的保护机制，抵抗随后可能发生的疾病损害。支气管哮喘是一种以气道炎症、气道高反应性、可逆性气道阻塞和气道重塑为主要特征的慢性气道疾病[3],针灸在减轻气道炎症及降低气道高反应性方面具有较好的效果[4-5]，但是在哮喘欲发而未发阶段，给予逆针灸干预是否能减轻哮喘急性发作还知之甚少。本研究通过观察逆针灸对过敏性哮喘大鼠血清白介素-2(IL-2)含量和肺组织中转录因子GATA结合蛋白3抗体(GATA-3)蛋白表达的影响，探讨逆针灸对过敏性哮喘大鼠的预保护机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

健康雄性SPF级SD大鼠40只，体质量160～180 g，由河南省实验动物中心提供，动物合格证号为SCXK(豫)2017-0001，动物使用许可证号为SYXK(豫)2015-0005。实验过程中对动物的处置严格遵守中国科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。动物自由饮水和摄食，定期更换垫料。室温为20～22 ℃，湿度60%～70%，通风良好。剔除疾病、意外死亡等不符合实验要求者。

1.2 试剂与仪器

卵蛋白(OVA)，北京索莱宝科技有限公司产品，批号20180521；氢氧化铝干粉,上海麦克林生化科技有限公司产品，批号20180411；质量分数9 g/L氯化钠注射液，河南科伦药业有限公司产品，批号A18020101-2；GATA-3一抗，武汉博士德生物工程有限公司产品，批号BA0885；无菌针灸针，直径0.25 mm、长度13 mm，北京中研太和医疗器械有限公司产品, 批号212160613；细艾条，南阳汉医艾绒有限责任公司产品，批号2016-11-20。晶体管超声雾化器，鞍山市无限电一厂产品；RM2015型切片机，德国Leica公司产品；BX43型光学显微镜，日本Olympus公司产品。

1.3 动物分组与模型的建立

在水和标准饲料充足条件下饲养大鼠1周，按随机数字表法分为正常对照组、模型对照组、逆针组和逆灸组。

除正常对照组外，其余各组动物均以新鲜配制的质量分数为100 g/L的复合OVA抗原溶液(每升抗原液中含有OVA 100 g，氢氧化铝干粉100 g)1 mL进行腹腔注射致敏。在实验的第1天和第8天各注射1次使大鼠致敏。第15天，将大鼠置于密闭的雾化箱内，由压缩雾化器喷入质量分数为10 g/L的卵蛋白溶液20 min激发哮喘，每天1次，连续7 d。7 d后，以如下标准判别模型是否成功：雾化初期大鼠表现为烦躁不安，抓耳挠腮，呼吸急促，活动频繁；后期大鼠出现俯伏不动，毛发无光泽，反应迟钝、精神萎靡不振。

1.4 各组大鼠的处理方法

逆针组：造模的同时，在致敏阶段给予隔天1次的针刺干预，连续2周；激发阶段给予每天1次的针刺干预，连续1周。取穴：肺俞(双)、大椎、风门(双)、足三里。采用直径0.25 mm、长度13 mm针灸针，大椎直刺5 mm，风门、肺俞直刺6 mm，足三里直刺7 mm。每次20 min，每隔10 min行针1次,平补平泻法。若适逢给予大鼠致敏或激发，则先针刺后致敏或激发。

逆灸组：造模的同时，在致敏阶段给予隔天1次的温和灸干预，连续2周；激发阶段给予每天1次的艾灸干预，连续1周。取穴：肺俞(双)、大椎、风门(双)、足三里。持细艾条行温和灸法，艾条距离上述穴位2～3 cm，每次灸20 min。若适逢给予大鼠致敏或激发，则先艾灸后致敏或激发。

正常对照组用生理盐水代替卵蛋白。正常对照组和模型对照组每天给予同样的抓握刺激，不做任何治疗。

1.5 检测指标

1.5.1 标本取材

最后1次治疗结束后24 h内用质量分数100 g/L的水合氯醛3.5 μL/g腹腔注射麻醉大鼠，脱颈椎处死大鼠，迅速打开胸腹腔，暴露出腹主动脉，用10 mL注射器抽取血液3～5 mL，置于普通试管，静置30 min，以3 000 r/min离心10 min，取上清，-20 ℃保存。取右肺中下叶，用4 ℃质量分数为9 g/L的氯化钠注射液漂洗干净，立即放入新鲜配制的质量分数为40 g/L的多聚甲醛溶液中固定24 h以上，用石蜡包埋，切片，待用于肺组织免疫组化检测。

1.5.2 肺组织形态学改变

肺组织常规石蜡包埋，二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，苏木素-伊红(HE)染色，常规脱水，透明，封片。显微镜下观察各组大鼠肺组织形态学改变。

1.5.3 IL-2含量

采用酶联免疫吸附法测定大鼠血清IL-2含量，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.5.4 肺组织GATA-3蛋白表达

采用免疫组织化学法检测。石蜡组织切片，切片用二甲苯脱蜡3次，各10 min，依次在无水乙醇、体积分数950 mL/L乙醇、800 mL/L乙醇、750 mL/L乙醇中浸泡，蒸馏水脱蜡至水化。将切片放入柠檬酸盐修复液中，高压修复2 min，在室温条件下自然冷却，用PBS缓冲液冲洗3次，每次5 min。滴加30 g/L 双氧水(即内源性过氧化物酶阻断剂)，室温孵育20 min，PBS冲洗3次，每次5 min。滴加一抗，4 ℃过夜，PBS洗3次，每次5 min。滴加二抗，37 ℃避光20 min，放入PBS中洗3次，每次5 min。配制DAB显色液，滴加到切片上，苏木素复染，常规脱水、透明，中性树胶封片。显微镜观察，测定阳性免疫染色强度及面积，结果采用平均光密度(MOD)表示。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠肺组织形态学改变

正常对照组大鼠肺部未见明显异常，肺泡及支气管形态结构基本正常，气道及周围血管有少量炎性细胞浸润。模型对照组大鼠气管及小血管周围可见大量的炎性细胞浸润；支气管管腔狭窄，管壁增厚；气道黏膜下组织水肿明显。逆针组和逆灸组均可见气管及其周围炎性细胞浸润，管腔狭窄，气道黏膜水肿，但与模型对照组对比炎性细胞浸润程度明显降低，管腔狭窄及水肿明显好转。见图1。

图1 各组大鼠肺组织形态学检查(HE染色，×400)

2.2 各组大鼠血清IL-2含量对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠血清IL-2含量升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，逆针组和逆灸组IL-2含量降低，差异有统计学意义(P<0.01)。逆针组和逆灸组之间IL-2含量对比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

组 别nIL-2/(ng·L-1)正常对照组10315.00±59.86模型对照组10719.80±73.27∗∗逆针组10559.40±60.12∗∗##逆灸组10618.80±67.61∗∗##

注：与正常对照组对比，**P<0.01；与模型对照组对比，##P<0.01。

2.3 各组大鼠肺组织GATA-3蛋白表达对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠GATA-3平均光密度值升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，逆针组和逆灸组GATA-3平均光密度值降低，差异有统计学意义(P值依次为P<0.05、P<0.01)。逆针组和逆灸组之间GATA-3蛋白表达对比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

组 别nGATA-3正常对照组100.021±0.007模型对照组100.054±0.014∗∗逆针组100.039±0.009∗#逆灸组100.035±0.010∗##

注：与正常对照组对比，*P<0.05；**P<0.01；与模型对照组对比，#P<0.05; ##P<0.01。

3 讨 论

治未病理论是中医学中承载着预防观念的学术思想，其内涵与西医学从治疗疾病向预防疾病转变的战略思想有异曲同工之处。《素问·四气调神大论篇》就已经提出“是故圣人不治已病治未病，不治已乱治未乱”。唐代孙思邈更是将疾病分为未病、欲病、已病3个层次，认为“上医医未病之病，中医医欲病之病，下医医已病之病”。在疾病发生前，采用合适的方法阻断疾病的发生，延缓疾病的发展，减少机体的损害，对防治疾病具有重大意义。

目前针灸治疗哮喘的研究内容颇丰，但多集中在哮喘发作以后的治疗效果和机制方面[6-7]，关于逆针灸对哮喘的预防性保护作用资料较少，尚未检索到详细报道。本研究在以往逆针灸作用机制研究的基础上，继续探讨逆针灸对过敏性哮喘大鼠的预保护作用及其机制。

哮喘属中医学“哮病”范畴。当机体在某些诱发因素如感冒、呼吸道细菌感染、吸入过敏原等作用下，就会成为哮喘高危人群，若不及时治疗便会进入哮喘持续发作阶段。当哮喘发作时，多种炎性细胞和细胞因子参与气道炎性反应，其中Thl和Th2细胞的分化平衡状态对哮喘的发生、发展起到重要作用。研究报道，转录因子T-bet和GATA-3是影响Thl与Th2细胞分化的关键决定因子[8]。其中GATA-3是Th2细胞分化必不可少的转录因子，其表达在Th2谱系分化的细胞中显著上调[9]。GATA-3是GATA的家族成员，仅在Th2细胞中表达。GATA-3一方面通过上调IL-4、IL-5等Th2型细胞因子的表达，活化趋化因子，吸引EOS、中性粒细胞等向呼吸道的炎症部位聚集和浸润，从而促进哮喘气道炎症的发生和发展；另一方面还可通过抑制Thl特异性转录因子T-bet促进Th2细胞分化，对多种靶基因起到促进和抑制作用[10]。研究发现，GATA-3 基因敲除大鼠合成Th2 细胞因子的能力显著降低，无法形成由Th2介导的气道炎症[11]。近年来，4q24-27染色体区域所含基因被认为与过敏性疾病密切相关[12]。IL-2基因恰位于4q27，IL-2是Thl细胞因子，可刺激T细胞MHCⅡ类抗原的表达，并产生γ-干扰素、肿瘤坏死因子-α等细胞因子从而发挥效应功能。另外，IL-2还可促进B细胞增殖和分泌抗体，产生Th2型细胞因子的效应。外周血或血浆中IL-2水平的变化会影响Thl与Th2分化平衡[13]。研究[14]报道，哮喘患者血清中IL-2的水平明显高于正常人，且IL-2的浓度与FEV1%预计值呈负相关。

本实验结果表明，与正常对照组对比，模型对照组大鼠血清IL-2含量明显升高，这与上述研究结果一致，而逆针组和逆灸组血清IL-2含量明显降低(P<0.05)。此说明逆针灸可以显著抑制哮喘大鼠血清中促炎因子的分泌，减轻气道炎症。同时逆针组和逆灸组还可以显著降低哮喘大鼠肺组织中GATA-3蛋白表达，表明逆针灸可通过降低GATA-3蛋白表达，抑制由Th2介导的气道炎症，从而减轻哮喘气道炎症的发生和发展。

逆针灸是中医治未病的重要手段。在哮喘欲发而未发阶段，通过增强机体免疫力，调动内源性保护机制是防止哮喘持续发作和减轻哮喘症状的有效措施。本实验在哮喘未发阶段即给予针、灸干预，结果表明, 能有效减轻哮喘大鼠的症状，抑制气道炎症反应和气道重塑 ,其作用机制可能与下调血清IL-2含量和降低肺组织中GATA-3蛋白表达有关，提示对哮喘大鼠具有预保护作用。