槟榔不同制品和槟酚对金黄地鼠口腔的致癌作用研究*

方 东，朱晓瑜，王庆端，王 军，许启泰

[1. 河南大学药学院，河南 开封 475004； 2.海南绿槟榔科技发展有限公司，海南 定安 571200；3. 河南省(郑州大学)医药科学研究院，河南 郑州 450052； 4. 河南省中医药研究院中药研究所，河南 郑州 450004]

槟榔为棕榈科植物槟榔ArecacatechuL.的干燥成熟种子，为中国四大南药之一。目前全世界嚼食槟榔的消费者有7亿人，槟榔与香烟、酒、咖啡被称为全球四大嗜好品[1-2]。近年来国内外有许多与槟榔有关的研究，其中讨论最多的当属槟榔是否能够导致口腔癌和食管癌的发生。口腔癌被认为是世界第六大常见癌症[3]。能引起口腔癌的因素很多，吸烟被认为是引起口腔癌发生发展的最危险因素[4]，饮酒也被证实可增加口腔癌的发生风险[5]，但是并没有发现咀嚼槟榔能独立升高口腔癌的发病风险[6]。本实验观察了槟榔不同制品和槟酚对金黄地鼠口腔的致癌作用，以期探究咀嚼槟榔是否与口腔癌的发生存在潜在关系，从而为人们食用槟榔提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级健康金黄地鼠120只，雌雄各半，体质量(100 ± 5)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0011。按实验动物使用的3 R原则给予人道关怀，实验在室温22～25 ℃、12 h 明暗交替环境中进行。

1.2 药品、试剂与仪器

成果槟榔选用口味王精制青果食用槟榔，湖南口味王集团有限责任公司产品，批号20190621；槟榔黑果及白果，购自海南绿槟榔科技发展有限公司，批号20190722。分别将槟榔黑果、白果、成果切开去核，用粉碎机将果实磨碎成粉末，用无菌水润湿，收集于密封袋内，置于4 ℃冰箱备用。乙醚购于北京 Solarbio科技有限公司，批号20180917；槟酚由海南绿槟榔科技发展有限公司提供，批号B20190408；肝素，购于阿拉丁试剂公司，批号C1627012；二甲基苯并蒽(DMBA)，购自sigma公司，批号089k7013，将其溶于丙酮，制成质量分数为5 g/L的溶液，现用现配；质量分数9 g/L氯化钠注射液,购自于北京Solarbio科技有限公司，批号20190427。

1.3 动物模型的建立与分组

适应性饲养1周后，将120只金黄地鼠按照雌雄各半随机分成正常对照组、黑果组、白果组、口味王组、槟酚组、DMBA组，每组20只。采用乙醚将金黄地鼠麻醉，用细砂纸将金黄地鼠两侧颊囊磨破，然后分别取槟榔黑果、槟榔白果、口味王、槟酚置于金黄地鼠颊囊中，给药量以双侧颊囊填满为止，放置后不再取出，由金黄地鼠嚼食；DMBA组金黄地鼠双侧颊囊分别给予0.1 mL 质量分数为5 g/L的DMBA。每周打磨1次，每2天给药1次，连续18周。正常对照组不做任何处理。

1.4 检测指标

给药结束后，肉眼观察各组金黄地鼠颊囊的变化，处死，取其两侧颊囊，以40 g/L 多聚甲醛固定，以不同体积分数的乙醇和二甲苯逐级脱水透明，石蜡包埋切片后贴于载玻片上，60 ℃烘箱中烤2 h备用。取切片二甲苯脱蜡，不同体积分数乙醇逐级脱水后，进行组织切片苏木素-伊红(HE)染色和微核染色，中性树胶封片，显微镜下观察、拍照，观测各组金黄地鼠颊囊有无病理变化。为了防止性别因素对实验结果产生的影响，将每组金黄地鼠以雌、雄分别统计。

2 结 果

2.1 各组金黄地鼠双侧颊囊大体观对比

与相同性别的正常对照组对比，黑果组、白果组、口味王组、槟酚组金黄地鼠双侧颊囊大体观无明显差异，DMBA组金黄地鼠口腔出现溃烂和肿瘤结节。同组的雌、雄鼠之间对比，双侧颊囊大体观无明显差异。见图1。

a-b：颊囊黏膜结构完整，表面光滑，无溃疡，无组织增生c-d：颊囊黏膜出现溃疡，黏膜内出现肿瘤结节，口腔周围黏膜溃烂e-l:颊囊黏膜结构完整，表面光滑，无溃疡，无组织增生，口腔内有少许食物残渣

图1 各组金黄地鼠双侧颊囊大体观对比

2.2 各组金黄地鼠颊囊组织学对比

与相同性别的正常对照组对比，黑果组、白果组、口味王组、槟酚组金黄地鼠颊囊组织无明显异常，细胞排列规则，有极性。DMBA组颊囊细胞排列紊乱，层次不清，癌细胞大量浸润。同组的雌、雄鼠之间对比，组织学改变无明显差异。见图2。

a-b、e-l：细胞排列规则，有极性c-d：细胞排列紊乱， 层次不清，癌细胞大量浸润

2.3 各组金黄地鼠颊囊微核染色对比

与相同性别的正常对照组对比，黑果组、白果组、口味王组、槟酚组金黄地鼠微核分裂不明显，而DMBA组有明显的微核分裂现象。同组的雌、雄鼠之间对比，微核分裂现象无明显差异。见图3。

a-b、e-l：细胞排列规则，微核染色较少c-d：细胞分布紊乱，微核染色数目多

3 讨 论

引起口腔癌的危险因素众多，其中吸烟、饮酒、病毒感染最为常见[3]，近年来专家学者开始研究槟榔是否对口腔癌的发生发展具有影响。我国槟榔产区主要集中在海南岛中部、南部、东南部等地，种植面积和总产量占全国的 99%，2000-2011 年呈现逐年递增趋势，2010年以后总产值已达35亿元以上[7]。可以说,对于主产地而言，槟榔的经济价值已经非常突出。在此背景下，研究槟榔对人们日常生活与健康的影响显得尤为重要。本实验结果显示，除DMBA组的金黄地鼠的颊囊组织发生癌变、微核分裂增多之外，槟榔不同制品组未见异常，表明单独喂食槟榔各制品的金黄地鼠的双侧颊囊并未发生癌变。当然，此结果不能排除因为动物的数量较少且槟榔致癌的发病率较低而未观察到槟榔不同制品致癌的可能。