3D打印中胶原蛋白应用的研究进展

张静，席玉松，张俊杰*

1. 淮海工学院海洋生命与水产学院（连云港 222000）；2. 中复神鹰碳纤维有限公司（连云港 222000）

胶原蛋白具有优良的生物学性质与功能，主要表现在免疫原性低、可生物降解性、生物相容性、促进细胞生长和血小板凝聚等方面。这些生物学特性与功能，使得胶原蛋白在生物医学领域被广泛应用于生物材料制备[1]。3D生物打印技术是指在计算机辅助下，按照预先设计的特定三维结构，对活细胞、生物活性组织及相关生物材料等基本构件进行逐层堆积的生物制造技术[2]。3D打印技术被逐渐引入生物医学领域。在一些生物材料支架制备过程中，胶原蛋白凭借着低毒性、可体内降解等优势，逐渐成为3D生物打印原材料的优先选择。

1 胶原蛋白的基本结构

胶原蛋白是一种天然的生物大分子，是哺乳动物细胞中含量最丰富的蛋白质，约占整个细胞总蛋白的1/4[3]。目前，已发现27种不同类型胶原蛋白，分别标记为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅵ型……其中，Ⅰ型胶原是组织分布最为广泛的一类胶原蛋白。典型的胶原蛋白分子是紧密结合的三螺旋结构，由3条肽链组成，包括2条α1链和1条α2链，3条肽链交互缠绕形成绳索状的超螺旋结构[3]，胶原蛋白分子结构十分稳定。

2 胶原蛋白的生物学特性

2.1 免疫原性低

胶原蛋白结构重复率较高，相比于其他具有免疫性的蛋白质，胶原蛋白免疫原性更低。因为，胶原蛋白的主要免疫原性位点是在分子的C、N末端区域，该区域被称为端肽，是由短的、非螺旋氨基酸序列所组成。在胶原蛋白提取过程中，端肽会被选择性水解或者去除而失去活性，仅在胶原蛋白分子的三股螺旋结构内保留一些微弱的免疫原性[4]。

2.2 可生物降解性

高分子生物降解是指材料在生物体内，能够被酶或微生物促进降解，高分子主链断裂、分子量逐渐变小，最终成为单体或代谢产物[5]。胶原蛋白紧密的螺旋结构使得大多数蛋白酶只能切断胶原蛋白的侧链，削弱胶原蛋白分子之间交联。胶原蛋白肽键只有在胶原酶作用下才会被破坏，人体内部组织中存在的胶原酶对促进胶原蛋白降解发挥很大作用[6]。

2.3 生物相容性

胶原蛋白具有良好的亲和性，能够帮助细胞和组织维持正常的生理功能。同时，优良的亲和性有利于细胞外间质网络状构成，提高细胞黏结性，使得胶原蛋白具有一定修复作用[7]。

2.4 促进细胞生长

胶原蛋白是细胞外间质的主要成分，也是细胞生长的良好培养基。在细胞的迁移、增殖过程中，胶原蛋白不仅提供营养基础，还起到支架作用[8]。陈悦玲等[9]发现胶原蛋白能引导上皮细胞迁移到人体缺损区，从而促进角膜上皮损伤修复及细胞生长。同时，胶原蛋白的降解产生物能够被新生细胞利用，合成新的胶原蛋白，在细胞中起到连接作用。

2.5 止血性

胶原蛋白具有促进血小板凝聚和血浆结块功能[10]。胶原蛋白纤维与血液接触后，血液中的血小板会与胶原蛋白纤维吸附在一起，发生凝聚反应，从而生成纤维蛋白，进而形成血栓，促进血浆结块达到阻止流血、促进凝血目的[1]。

3 胶原蛋白在3D打印技术中的应用研究进展

在生物医学领域中，胶原蛋白被广泛用于制备人工组织工程支架、可吸收手术缝合线、止血海绵、人工骨骼、人造皮肤、心脏瓣膜等医用材料。

3.1 打印组织修复材料

3D生物打印技术可用于组织修复材料的打印，如皮肤、人工软骨等。胶原蛋白对上皮细胞起到增生修复的作用，有利于促进创面的愈合，可广泛应用于烧伤和创伤治疗。Lee等[11]利用胶原蛋白为原料，逐层打印出仿皮层和真皮层的多层皮肤组织，并将打印成型的三维皮肤浸泡于培养基内，促进皮肤组织的成熟与分层。Koch等[12]将细胞与胶原蛋白混合，打印出多层皮肤结构，研究结果显示，细胞能够很好地进行增殖生长并形成连接。3D打印可根据伤口面积的大小精确打印出所需要皮肤，避免患者自体移植的手术痛苦。Yang等[13]利用Ⅰ型胶原蛋白与海藻酸钠混合材料打印出软骨组织。

3.2 打印组织替代物

胶原蛋白可作为多种组织替代物用于生物医学领域。有关数据显示，全球每70名角膜损伤患者中，只有1人有机会得到角膜移植，可供移植的角膜数量远不能满足患者需求。英国纽卡斯尔大学遗传医学研究所研究人员将胶原蛋白、海藻酸盐及人类角膜细胞混合制备为打印原材料，通过对患者眼睛进行扫描，得到角膜大小、形状等数据，利用3D打印技术打印出成型的人体角膜[14]。整个打印过程不到10 min，但打印出的角膜尚未经人体试验，一旦打印出的角膜被证明能用于人体移植，这一技术将造福于人类。

3.3 打印组织工程支架

在现今生物医学领域中，组织工程支架无疑是研究热点。生物支架是细胞黏附的基本框架，也是细胞增殖分化场所，在构建仿生组织和器官中起到重要作用。如利用自体软骨细胞移植治疗软骨损伤，既不易获得且容易造成二次伤害[15]；如使用异体软骨移植，无法完全避免排斥反应，并且生物学性能、功能和正常软骨组织相比差距较大[16]。将胶原蛋白作为主要原料打印出的组织工程支架，有利于细胞黏附，对细胞起到支撑保护作用，使得软骨损伤完全修复成为可能[17]。

3D打印的支架原料大体来自两类：一类由人工合成的生物材料制成，主要包括聚乳酸、聚氨基酸、聚羟基乙酸及聚偶磷氮[18]；另一类来自动植物体内的天然生物材料，包括胶原蛋白、壳聚糖、纤维蛋白和海藻酸盐[19]。孙凯等[20]以丝素、胶原蛋白2种材料为打印基质，利用3D打印技术打印出组织工程支架。丝素与胶原蛋白质量比2︰1时，支架的理化性质与生物相容性最佳。袁清献等[21]采用丝素蛋白和Ⅱ型胶原蛋白作为支架的原材料，通过3D打印和冷冻干燥技术制备出具备网格状的三维软骨支架。在支架上接种软骨细胞，细胞可以很好地进行增殖分化，符合软骨组织工程的要求。朱旭[22]对3D打印的胶原蛋白-壳聚糖支架在脊髓的损伤修复方面发挥作用进行研究，打印的支架具有完美的内部三维立体多孔结构，能促进脊髓神经纤维再生及运动功能恢复。

组织工程是3D生物打印技术中最前沿的研究领域，由于3D技术具有个性化、准确性及擅长制作复杂实体特点，为疾病治疗找到发展方向。

4 水产胶原蛋白在3D打印中的应用现状

4.1 应用现状

水产胶原蛋白在一定程度上可以替代陆生动物胶原蛋白在3D打印中所发挥作用。朱伟等[23]通过研究发现，从鱼鳞中提取的胶原蛋白对免疫低下小鼠的皮肤伤口具有明显促进愈合作用。Van Essen等[24]研究从鱼鳞中提取胶原蛋白，发现其透光度和散射性与人类角膜的性质基本一致，能满足人类角膜组织构建基本要求。Mredha等[25]利用鱼鳔提取胶原蛋白，制备成水凝胶用于人工软骨及骨修复材料中，该水凝胶与骨质结合极为紧密，且机械强度较高，承重性能好，是一种良好生物材料。相较于陆生动物所提取的胶原蛋白，水产胶原蛋白具有污染性小、生物安全性高等特点。由于中国水产资源丰富，水产养殖、加工业的发展产生大量鱼皮、鱼鳞等下脚料，使得提取胶原蛋白所需的原料价格较为低廉。

在一些伊斯兰国家，由于宗教信仰等原因，从猪皮、猪骨中提取的胶原蛋白所制备的产品不能被穆斯林民众所接受。而水产胶原蛋白由水产品中提取，避免宗教禁忌问题，帮助胶原蛋白产品破除宗教壁垒，并发挥效用。

3D打印中，水产胶原蛋白能够发挥与陆生动物胶原蛋白同样作用，且具有安全无毒、价格便宜等优势，为3D打印的使用材料提供选择。

4.2 存在问题

作为3D打印材料，相比于猪、牛等陆生动物胶原蛋白，水产胶原蛋白虽然更安全，但同时也存在热稳定性低的问题。胶原蛋白的三螺旋结构会随着温度升高而解开，形成单条肽链，加热变性后的胶原蛋白理化性质会发生较大改变[26]。

张俊杰等[27]从鳕鱼皮中提取酸溶性胶原蛋白（ASC），经分析发现其变性温度19.0 ℃。卓素珍[28]测得从鲳鱼皮、鮟鱇鱼皮中提取的胶原蛋白热变性温度分别为21.91和22.09 ℃。段蕊等[29]研究冬夏鲢鱼鳞胶原蛋白稳定性，结果显示，夏季样品变性温度36℃，冬季样品出现2个值，分别为30和34 ℃。张俊杰等[30-31]从鲤鱼皮中提取的胶原蛋白变性温度28 ℃，从鲤鱼鳞所提的酸溶性和酶溶性胶原蛋白（PSC）变性温度分别为32和28 ℃。张建忠[32]测得的草鱼皮ASC和PSC热变性温度分别为33.8和34.5 ℃。而猪皮胶原蛋白的变性温度38.91 ℃，牛跟腱胶原蛋白的变性温度

38.10 ℃。

一般情况下，从猪、牛等陆生动物中提取的胶原蛋白热稳定性高于水产动物中提取的胶原蛋白，淡水鱼提取的胶原蛋白变性温度较高于海水鱼。打印过程中，由于水产胶原蛋白的热稳定性较低，容易使材料性质发生改变，且由于陆生动物胶原蛋白的热变性温度更接近人体温度，比水产胶原蛋白更能满足于组织工程的应用。

5 打印过程中的问题

5.1 造价昂贵、定制周期长

3D打印技术所制造的产品需要根据患者情况进行打印，能够满足于个性化需求，但也由于个性化的特点，无法做到批量生产，生产造价高，成本昂贵。同时，因为患者情况各不相同，每次的产品都需重新制定打印方案，所耗费时间较长。

5.2 生物安全性问题

现在的3D生物打印所打印出的组织器官大多通过动物实验检验成果，但动物体内环境与人体环境有很大区别，动物实验的成功并不能代表打印出的组织器官完全适用于人体。生物打印所选用的打印基质是从动物体内提取的胶原蛋白，与人体自身的胶原蛋白有一定差异性，要考虑免疫排斥、外源性病毒感染等问题。

5.3 机械强度差

以胶原蛋白为原料打印的支架不仅有利于细胞黏附，并且对细胞起到支持保护作用，但是存在机械应力强度不足问题。支架的孔隙结构对支架的力学性能影响极大，打印出的支架三维结构内部的孔径大小和形状对细胞增殖与迁移有重要意义。胶原蛋白作为打印基质所打印的支架，微孔结构、孔径和空隙率并不能达到理想效果。

6 展望

3D打印技术有着数字化、信息化、准确化等优势，逐渐成为如今生物医学领域的研究热点和发展方向。尽管中国3D打印技术起步较晚，但近年来已打印出肝脏、血管等人体组织器官。3D打印技术可以更好地应用于生物医学领域，为人类健康做出贡献。同时，水产胶原蛋白来源广泛，可以从水产品下脚料中提取，原料价格低廉，并可达到节约资源、保护环境的目的。然而，水产胶原蛋白在3D打印中应用较少，主要由于热稳定较差，且结构、功能与陆生动物来源的胶原蛋白有一定差异性。但从各类鱼的变性温度可以看出，淡水鱼提取的胶原蛋白变性温度普遍高于海水鱼，且较接近陆生动物的变性温度，通过体外自组装等方法可以提高胶原蛋白热稳定性，有望使淡水鱼作为陆生动物胶原蛋白替代品。为更好发挥水产胶原蛋白应用潜力，应开展大量基础研究及临床试验，为水产胶原蛋白的使用提供依据。