羧基化多壁碳纳米管单一及其与镉复合处理对水稻幼苗叶片毒性效应的研究

刘 玲， 杨俊文， 陈 成， 戴慧芳， 许婷婷， 孟 壮， 方炎明

(1. 淮南师范学院生物工程学院， 安徽 淮南 232038； 2. 南京林业大学生物与环境学院， 江苏 南京 210037)

碳纳米管(CNTs)是一种纤维化的纳米材料，因其具有自收缩、抗裂、增韧和半导体等特性被广泛应用于工业、陶瓷业和信息工程等领域[1-3]。由于对CNTs持续的开发、生产和应用，CNTs不可避免地释放到环境中[4-5]。植物是生态系统的生产者，在从土壤或水体吸收营养的同时伴随着对其中CNTs的吸附，植物对CNTs具有潜在的累积效应，被认为是CNTs进入生物循环的重要途径[6-7]。因此，研究CNTs对植物生长的毒性效应及其在环境中的迁移和转化至关重要。CNTs分为单壁碳纳米管(SWCNTs)和多壁碳纳米管(MWCNTs)，其中，MWCNTs具有较强的抗压抗折[8-9]和导电导热能力[10-11]，且成本较低，易制取，用途广泛[12]。MWCNTs的表面功能化能改变材料本身的化学和物理学特性，使其稳定性和生物相容性增加，从而增强材料本身的工业化应用潜力[13]。羧基化多壁碳纳米管(MWCNTs-COOH)作为MWCNTs表面功能化的典型代表，其分散性和亲水性更佳，市场应用前景更广。

近年来，MWCNTs和MWCNTs-COOH的生态安全性受到人们越来越多的关注。研究结果表明：MWCNTs可降低微生物活力[14]，引起小鼠骨髓细胞和人体淋巴细胞染色体畸变和DNA异常，影响肝脏代谢功能，对哺乳动物具有潜在毒性[15-17]。高浓度MWCNTs不仅抑制藻细胞增殖，降低叶绿素a含量和抗氧化酶活性[18-19]，还对作物根和叶的形态产生不利影响[20]。另外，MWCNTs团聚物对植物细胞也存在胁迫，干扰拟南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕T87悬浮细胞的干质量、通透性和超氧化物歧化酶(SOD)活性等[21]。MWCNTs-COOH进入植物体内，致使叶片氧化损伤加剧，植物亚细胞结构被破坏[22]。

MWCNTs-COOH具有较大的比表面积且易分散在水体中，其吸附性能得到极大发挥，易成为有机和重金属污染物的载体，并对其毒性产生影响[23-24]。已有研究结果证明：MWCNTs-COOH具有吸附重金属的能力，并能够促进重金属离子向植物根和叶细胞内部渗透[22]。在MWCNTs-COOH和重金属复合污染的环境介质中，二者间不可避免地会发生相互作用，进而干扰重金属的环境行为和对生态系统的毒性效应[25]。目前，关于单一MWCNTs-COOH或镉(Cd)对植物生长影响的研究很多，而关于MWCNTs-COOH与Cd复合作用下对植物生长影响的研究较少，MWCNTs-COOH与Cd复合作用对植物的毒性作用机制尚不明确。为此，本研究以水稻(OryzasativaLinn.)品种‘Y两优900’(‘Y Liangyou 900’)幼苗为实验对象，选取Cd作为典型重金属，研究水稻幼苗在MWCNTs-COOH单一及其与Cd复合处理下叶片生理特性的变化，以期为早期诊断和科学评价MWCNTs-COOH与Cd复合污染的生态风险提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 羧基化多壁碳纳米管(MWCNTs-COOH)及镉(Cd)的母液配制 MWCNTs-COOH(外径8～15 nm，长0.5～2.0 μm，纯度大于95%)购自中国科学院成都有机化学有限公司。取500 mg MWCNTs-COOH，加入适量的去离子水，使用SCIENTZ JY92-Ⅱ超声波破碎仪(河北慧采科技开发有限公司)于650 W超声振荡150次，每次振荡15 s、间歇10 s，最后定容至500 mL，制成1 mg·mL-1MWCNTs-COOH母液，备用，使用时进行稀释。

供试Cd源为氯化镉(CdCl2·2.5H2O)。取1.140 g氯化镉，加入适量去离子水溶解，然后定容至500 mL，制成10 μmol·mL-1Cd母液，备用，使用时进行稀释。

1.1.2 水稻幼苗培养 将籽粒饱满、大小基本一致的水稻品种‘Y两优900’种子(湖南袁创超级稻技术有限公司)进行浸种催芽(0.1 mol·L-1HNO3溶液浸泡16～24 h，去离子水清洗后，于30 ℃水浴中浸泡2 d，每天换水2次)，种子露白后，放在铺有湿润纱布的白瓷盘中，于黑暗条件、30 ℃人工气候箱中培育。待幼芽长至约5 mm时，挑选芽势相近的萌发种子悬浮培养于1/4 Hoagland营养液中(漂浮板固定)，于光照度3 000 lx、光照时间16 h·d-1和空气相对湿度70%条件下进行培养，每3 d更换1次培养液。待第3枚真叶长出，株高和直径分别达7.5 cm和0.5 cm 左右(种子萌发21 d)，移植到培养盒(长320 mm、宽240 mm、高120 mm)中进行处理，每盒48株幼苗。

1.2 方法

1.2.1 处理方法 设置MWCNTs-COOH单一及MWCNTs-COOH-Cd复合处理，共10个处理：CK1不添加MWCNTs-COOH，即0 mg·L-1MWCNTs-COOH；S1、S2、S3和S4单一处理分别添加1.5、3、6和12 mg·L-1MWCNTs-COOH；CK2添加10 μmol·L-1Cd；C1、C2、C3和C4复合处理分别添加1.5、3、6和12 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd，基础培养液为Hoagland营养液，pH 5.3至pH 5.5。每7 d更换1次处理液。21 d后，测定和观察叶片相关指标。每个处理种植3个培养盒，即为3次重复。

SOD活性的测定采用氮蓝四唑(NBT)光还原法[27]218-219并略有改动。称取叶片0.5 g，加入5倍于样品质量的50 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.8)冰浴研磨，经10 000 r·min-1离心20 min，上清液为粗酶提取液。取粗酶提取液0.1 mL，加入50 mmol·L-1磷酸缓冲液3.5 mL、130 mmol·L-1混合型甲硫氨酸0.5 mL、750 μmol·L-1NBT 0.5 mL、100 μmol·L-1EDTA-Na20.5 mL、蒸馏水0.4 mL和20 μmol·L-1核黄素0.5 mL(最后加入)，在光照度2 000 lx条件下照射12 min后立即测定OD560，计算SOD活性。

各处理每个指标均重复测定3次。

1.2.3 叶片H2O2定位 叶片H2O2定位参考王晨芳[28]的二氨基联苯胺(DAB)染色法并略有改动。于每个培养盒中随机选取3株水稻幼苗的倒三叶置于锥形瓶中，加1 mg·mL-1DAB染液浸没，于黑暗条件、120 r·min-1摇床振荡过夜后，光照度2 000 lx下照射至所有叶片出现褐色斑点。然后将水稻叶片从DAB染液中取出，加脱色液〔V(无水乙醇)∶V(甘油)∶V(去离子水)=15∶1∶4〕后，于80 ℃水浴脱色30 min，将脱色的叶片抽真空后平铺于滤纸上，对比不同处理和对照间各叶片颜色的差异并拍照。每处理3次重复。

1.3 数据统计

采用SPSS 18.0统计分析软件进行数据处理和分析，利用单因素方差分析进行差异显著性检验。

2 结果和分析

2.1 MWCNTs-COOH单一及MWCNTs-COOH-Cd复合处理对水稻幼苗叶片生理指标的影响

MWCNTs-COOH单一及MWCNTs-COOH-Cd复合处理对水稻幼苗叶片生理指标的影响见表1。

2.1.1 对叶绿素含量的影响 由表1可见：随着MWCNTs-COOH质量浓度提高，MWCNTs-COOH单一处理组水稻幼苗叶片叶绿素含量呈逐渐降低的趋势，但与0 mg·L-1MWCNTs-COOH(CK1)组间均无显著差异；MWCNTs-COOH-Cd复合处理组水稻幼苗叶片叶绿素含量的变化趋势与MWCNTs-COOH单一处理组相同，其中，1.5 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd(C1)和3 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd(C2)复合处理组的叶绿素含量均高于0 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd(CK2)组，12 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd(C4)复合处理组的叶绿素含量较CK2组显著(P<0.05)降低。同一质量浓度MWCNTs-COOH-Cd复合处理组的叶绿素含量均低于MWCNTs-COOH单一处理组，其中，C4复合处理组与12 mg·L-1MWCNTs-COOH(S4)单一处理组间差异显著。

2.1.2 对超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响 由表1还可见：随着MWCNTs-COOH质量浓度提高，MWCNTs-COOH单一处理组水稻幼苗叶片SOD活性呈先升高后降低的趋势，4个MWCNTs-COOH单一处理组水稻幼苗叶片SOD活性均高于CK1组，其中，6 mg·L-1MWCNTs-COOH(S3)单一处理组的SOD活性(24.70 U·mg-1)最高；MWCNTs-COOH-Cd复合处理组水稻幼苗叶片SOD活性呈逐渐降低的趋势，其中，C1复合处理组的SOD活性(21.59 U·mg-1)最高。同一质量浓度MWCNTs-COOH-Cd复合处理组的SOD活性均低于MWCNTs-COOH单一处理组，其中，C2、6 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd(C3)和C4复合处理组分别与对应的单一处理组间差异显著。

2.1.3 对过氧化物酶(POD)活性的影响 由表1还可见：随着MWCNTs-COOH质量浓度提高，MWCNTs-COOH单一处理组水稻幼苗叶片POD活性呈先升高后降低的趋势，其中，3 mg·L-1MWCNTs-COOH(S2)和S3单一处理组的POD活性较高，与CK1组间差异显著，之后POD活性显著降低；MWCNTs-COOH-Cd复合处理组水稻幼苗叶片POD活性呈“降低—显著升高—降低”的趋势。同一质量浓度MWCNTs-COOH-Cd复合处理组与MWCNTs-COOH单一处理组间水稻幼苗叶片POD活性均存在显著差异。

2.1.4 对丙二醛(MDA)含量的影响 由表1还可见：随着MWCNTs-COOH质量浓度提高，MWCNTs-COOH单一处理组水稻幼苗叶片MDA含量呈逐渐升高的趋势，其中，S3和S4单一处理组的MDA含量较高，分别较CK1组显著升高了17.1%和23.4%；MWCNTs-COOH-Cd复合处理组水稻幼苗叶片MDA含量的变化趋势与MWCNTs-COOH单一处理组相同，但不同质量浓度MWCNTs-COOH-Cd复合处理组间的MDA含量无显著差异。同一质量浓度MWCNTs-COOH-Cd复合处理组的MDA含量均高于MWCNTs-COOH单一处理组，但均无显著差异。

2.2 MWCNTs-COOH单一及MWCNTs-COOH-Cd复合处理对水稻幼苗叶片H2O2定位的影响

MWCNTs-COOH单一及MWCNTs-COOH-Cd复合处理对水稻幼苗叶片H2O2定位的影响见图1。由图1可见：1.5 mg·L-1MWCNTs-COOH单一处理组与1.5 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd复合处理组间水稻幼苗叶片褐色斑点面积差异不大；与0 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd组相比，6 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd和12 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd复合处理组叶片褐色斑点面积增大、颜色加深。

CK1： 0 mg·L-1MWCNTs-COOH； S1： 1.5 mg·L-1MWCNTs-COOH； S2： 3 mg·L-1MWCNTs-COOH； S3： 6 mg·L-1MWCNTs-COOH； S4： 12 mg·L-1MWCNTs-COOH； CK2： 0 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd； C1： 1.5 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd； C2： 3 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd； C3： 6 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd； C4： 12 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd.

图1 MWCNTs-COOH单一及MWCNTs-COOH-Cd复合处理对水稻幼苗叶片H2O2定位的影响

Fig. 1 Effect of single MWCNTs-COOH and combined MWCNTs-COOH-Cd treatments on H2O2localization of leaves ofOryzasativaLinn. seedlings

3 讨 论

叶绿素含量是反映植物光合作用水平的基本指标[29]。杨祥宇[30]的研究结果表明：1～50 mg·L-1纳米二氧化钛能够提高黄瓜(CucumissativusLinn.)和芦苇〔Phragmitesaustralis(Cav.) Trin. ex Steud.〕等植物的光合色素含量。本研究中，1.5 mg·L-1MWCNTs-COOH(S1)单一处理组水稻幼苗叶片叶绿素含量最高，而12 mg·L-1MWCNTs-COOH-10 μmol·L-1Cd(C4)复合处理组的叶绿素含量最低，说明低质量浓度MWCNTs-COOH可能对水稻生长具有一定的促进作用，高质量浓度MWCNTs-COOH和重金属Cd共同作用则会对水稻造成毒害作用，使叶绿素合成受抑制，进而导致叶绿素含量下降。MWCNTs-COOH单一及其与Cd复合处理均较纳米二氧化钛对植物的毒性更强，这可能与纳米材料和植物种类有关[31]，但具体原因还有待深入研究。

综上所述，高质量浓度MWCNTs-COOH单一及其与Cd复合处理对水稻幼苗叶片生理和生长影响显著，主要表现为SOD和POD活性降低、MDA含量升高、叶绿素降解及叶片受损伤等，因此，要降低MWCNTs-COOH与Cd复合作用带来的生态风险。