miR-107靶向PCDH17表达调控EMT通路抑制胃癌细胞迁移、侵袭的分子机制

于志红 张娟 刘培民

(河南省中医院 河南中医药大学第二附属医院，河南 郑州 450002)

胃癌属于临床常见恶性肿瘤且严重威胁人类生命安全，胃癌转移是胃癌患者治疗效果不佳及不良预后的重要原因〔1〕。研究表明上皮-间充质转化(EMT)可参与多种恶性肿瘤转移过程，其主要特点为上皮标志蛋白上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)表达降低，而间质标志蛋白神经型钙黏蛋白(N-cadherin)与波形蛋白(Vimentin)表达升高，提示EMT途径活化可能促进胃癌转移进程〔2〕。沉默小核仁RNA宿主基因(SNHG)6表达可抑制胃癌细胞EMT进而抑制癌细胞转移，既往研究表明抑癌基因过表达可通过抑制EMT进而抑制胃癌细胞转移〔3，4〕。因而如何抑制EMT过程是抑制胃癌转移的重要环节。微小RNA(miR)-107在胃癌细胞中高表达，抑制miR-107表达可抑制胃癌细胞生长、迁移和侵袭，但关于其具体调控机制尚未完全阐明〔5〕。原钙黏蛋白(PCDH)17是肿瘤抑制因子，研究显示PCDH17可抑制鼻咽癌发生及发展〔6〕。PCDH-17可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路进而抑制乳腺癌细胞转移〔7〕。通过TargetScan预测miR-107的靶基因，发现PCDH17的3′UTR上存在miR-107靶向结合位点，提示PCDH17可能是miR-107的靶基因，因此，本研究主要探讨miR-107是否可通过调控靶基因PCDH17表达而调节EMT途径进而影响胃癌细胞迁移、侵袭，为揭示胃癌转移发生机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1一般资料 选取2017年8月至2019年3月河南省中医院院收治的胃癌患者90例为研究对象，患者均经手术病理证实为胃癌，均接受手术治疗，其中男50例，女40例，年龄为50～70岁，平均年龄为(63.25±7.30)岁，患者术前均未接受放疗或化疗，根据TNM分期标准分为Ⅰ期20例、Ⅱ期30例、Ⅲ期35例、Ⅳ期5例；分化程度：低分化35例，中分化25例，高分化30例。术中切取胃癌组织及癌旁组织，放入液氮中保存。

1.2材料与试剂 胃癌MKN-28细胞购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)。DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；PCDH17、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin单克隆抗体均购自美国Abcam公司；Transwell小室购自美国Millipore公司；基质胶购自美国BD公司；miR-107模拟物(mimics)及阴性对照、miR-107抑制物(anti-miR-107)及阴性对照、siRNA-PCDH17及其阴性对照均购自上海吉玛制药技术有限公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒与实时荧光定量PCR试剂盒均购自上海吉玛基因有限公司。

1.3方法

1.3.1细胞转染及分组 胃癌MKN-28细胞培养条件：含有10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2培养箱内培养。实验将胃癌MKN-28细胞随机分为pcDNA-con组(转染空质粒)、pcDNA-PCDH17组(转染PCDH17过表达质粒)、si-con组(转染PCDH17阴性对照)、si-PCDH17组(转染siRNA-PCDH17)、pcDNA-PCDH17+miR-con组(共转染PCDH17过表达质粒与miR-con)、pcDNA-PCDH17+miR-107组(共转染PCDH17过表达质粒与miR-107 mimics)。转染前更换为不含胎牛血清 DMEM培养基，转染后6 h更换完全DMEM培养基，继续培养48 h。

1.3.2qRT-PCR检测细胞中miR-107、PCDH17 mRNA表达水平 取胃癌组织及癌旁组织，加入1 ml Trizol试剂提取组织总RNA，收集对数生长期胃癌MKN-28细胞，加入700 μl裂解液提取细胞总RNA，测定RNA浓度与纯度，参照反转录试剂盒进行反转录合成cDNA，qRT-PCR：预变性95℃ 5 min循环1次，(变性)95℃ 15 s，(退火)60℃ 20 s，(延伸)72℃ 10 s(共重复40次循环)。每个样品均设置3个复孔，反应结束后观察荧光反应曲线及扩增效率、循环阈值(Ct)，采用2-ΔΔCt法计算miR-107、PCDH17 mRNA相对表达量。

1.3.3Transwell实验检测细胞迁移及侵袭 细胞迁移实验：取对数生长期胃癌MKN-28细胞，加入无血清DMEM培养基制备细胞悬液，调整细胞密度为2×105/ml，Transwell小室(孔径8 μm)的上室加入100 μl细胞悬液，另取600 μl含有10%胎牛血清的DMEM培养液，放入37℃、5%CO2体积分数培养箱内继续培养24 h，弃Transwell小室上室内液体，使用无水甲醇固定30 min，用棉签擦去Transwell小室上室为过膜的细胞，用0.1%结晶紫染色20 min，置于倒置显微镜下观察迁移细胞数。细胞侵袭实验：预先用无血清DMEM培养基稀释基质胶(稀释比1∶3)，取40 μl稀释基质胶平铺于Transwell小室(孔径8 μm)底部的上室面，放入37℃、5%CO2体积分数培养箱内继续培养30 min，其余实验步骤同细胞迁移实验。

1.3.4荧光素酶报告基因检测miR-107靶基因 用TargetScan预测miR-107的靶基因，发现PCDH17的3′UTR上存在miR-107靶向结合位点，提示PCDH17可能是miR-107的靶基因，将PCDH17的3′UTR克隆并连接到报告基因载体(WT-PCDH17)，同时将含3′UTR结合位点进行突变的序列连接到报告基因载体(MUT-PCDH17)。同时取对数生长期MKN-28细胞，按照每孔2×104个细胞的密度接种于24孔板，放入37℃、5%CO2体积分数培养箱内培养，WT-PCDH17与miR-107 mimics共同转染至MKN-28细胞，记为(3′UTR-WT)miR-107组，以共转染miR-con为对照，记为(3′UTR-WT)miR-con组；将miR-107 mimics与MUT-PCDH17共转染至MKN-28细胞，记为(3′UTR-MUT)miR-107组，以共转染miR-con为对照，记为(3′UTR-MUT)miR-con组，转染48 h，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组细胞荧光素酶相对活性。为进一步验证miR-107与PCDH17的靶向调控关系，分别将miR-107 mimics、anti-miR-107转染至MKN-28细胞，以阴性转染为对照，分别记为miR-107组、miR-con组、anti-miR-107组、anti-miR-con组，采用Western印迹法检测各组细胞中PCDH17蛋白表达。

1.3.5Western印迹检测PCDH17、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin蛋白表达 取各组MKN-28细胞，加入蛋白裂解液〔1 ml RIPA、1%苯甲基磺酰氟(PMSF)、0.1% 抑肽酶〕，冰上裂解30 min提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，加入加样缓冲液促使蛋白变性，取30 μg蛋白样本上样，预先制备10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温条件下用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗(稀释比1∶1 000)，4℃孵育24 h，TBST洗涤，加入二抗(稀释比1∶5 000)，室温孵育2 h，加入电化学发光(ECL)液，采用Quantityone软件检测条带灰度值，蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参照条带灰度值。

1.4统计学处理 应用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1胃癌组织及癌旁组织中miR-107、PCDH17表达比较 与癌旁组织相比，胃癌组织中miR-107的表达水平显著升高(1.01±0.10 vs 3.59±0.30，P<0.05)，而PCDH17 mRNA的表达水平显著降低(1.02±0.11 vs 0.48±0.04，P<0.05)。

2.2PCDH17对MKN-28胃癌细胞迁移和侵袭的影响 与pcDNA-con组相比，pcDNA-PCDH17组胃癌MKN-28细胞迁移及侵袭细胞数均显著减少(P<0.05)；与si-con组相比，si-PCDH17组胃癌MKN-28细胞迁移及侵袭细胞数均显著增加(P<0.05)，见图1、表1。

2.3PCDH17对胃癌细胞EMT标志物E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin表达的影响 相对于pcDNA-con组，pcDNA-PCDH17组胃癌MKN-28细胞E-Cadherin表达水平显著升高(P<0.05)，而N-Cadherin、Vimentin表达水平均显著降低(P<0.05)；与si-con组相比，si-PCDH17组胃癌MKN-28细胞E-Cadherin表达水平显著降低(P<0.05)，而N-Cadherin、Vimentin表达水平均显著升高(P<0.05)，见图2、表2。

1～4：pcDNA-con组、si-con组、pcDNA-PCDH17组、si-PCDH17组；图2同

表1 PCDH17对MKN-28胃癌细胞迁移和侵袭的影响

与pcDNA-con组比较:1)P<0.05；与si-con组比较:2)P<0.05；表2同

图2 Western印迹检测E细胞EMT标志物E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin表达的影响

表2 PCDH17对胃癌细胞EMT标志物E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin表达的影响

2.4miR-107靶向PCDH17 TargetScan预测结果显示miR-107与PCDH17存在结合位点，见图3。双荧光素酶报告基因实验结果显示，WT-PCDH17、miR-107 mimics共转染组与WT-PCDH17、miR-con共转染组相比细胞荧光活性显著降低(P<0.05)；而MUT-PCDH17、miR-107 mimics共转染组与MUT-PCDH17、miR-con共转染组相比细胞荧光活性变化不显著(P>0.05)，见表3。表明miR-107可靶向结合PCDH17并负向调控其活性。进一步研究显示，miR-107组胃癌MKN-28细胞PCDH17蛋白表达水平显著低于miR-con组(0.15±0.03 vs 0.40±0.05，P<0.05)，anti-miR-107组胃癌MKN-28细胞PCDH17蛋白表达水平显著高于anti-miR-con组(1.05±0.10 vs 0.35±0.05，P<0.05)，见图4。

图3 TargetScan对miR-107和PCDH17结合进行预测

表3 miR-con或miR-107与报告质粒共转染MKN-28细胞后双荧光素酶活性检测

2.5高表达miR-107可以部分逆转PCDH17高表达对MKN-28迁移和侵袭的影响 与pcDNA-PCDH17+miR-con组相比，pcDNA-PCDH17+miR-107组胃癌MKN-28细胞迁移及侵袭细胞数均显著增加(P<0.05)，N-Cadherin、Vimentin蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)，而E-Cadherin蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与pcDNA-con组比较，pcDNA-pcDH17组胃癌MKN-28细胞迁移及侵袭细胞数、N-Cadherin、Vimentin蛋白表达水平均显著降低(均P<0.05)，而E-Cadherin蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，见图5、表5。

1～4：miR-con组、miR-107组、anti-miR-con组、anti-miR-107组

1～4：pcDNA-con组、pcDNA-PCDH17组、pcDNA-PCDH17+miR-con组、pcDNA-PCDH17+miR-107组

表5 高表达miR-107可以部分逆转PCDH17高表达对MKN-28迁移和侵袭的影响

与pcDNA-con组比较：1)P<0.05；与pcDNA-PCDH17+miR-con组比较：2)P<0.05

3 讨 论

胃癌死亡率逐年增加，目前临床主要采用手术、化疗或放疗等方式治疗胃癌，但患者总体生存期仍未明显延长〔8〕。EMT在肿瘤转移、伤口愈合呈多种生理病理过程中发挥重要调控作用，研究表明EMT可在膀胱癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤转移过程中发挥重要作用〔9，10〕。但诱导肿瘤细胞发生EMT的分子机制仍未完全阐明。

miR-107在人子宫内膜样腺癌细胞中表达上调，抑制miR-107表达可抑制肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭〔11〕。结肠直肠癌细胞中miR-107上调表达，下调miR-107表达可抑制细胞增殖〔12〕。miR-107通过靶向调控前列腺细胞凋亡反应(Par)4而促进细胞增殖及抑制结肠癌细胞凋亡〔13〕。但相关报道发现miR-107通过靶向PI3K/AKT途径而抑制胃癌细胞增殖及转移〔14〕。本研究结果显示胃癌组织及细胞系中miR-107的表达量明显升高，这可能是由于miR-107可调控多个靶基因表达进而参与胃癌发生及发展过程，靶基因在肿瘤中的表达及其作用机制不同导致miR-107在胃癌中发挥作用不同，因此本研究从多角度分析miR-107在胃癌转移过程中的作用机制。通过靶基因预测显示PCDH17可能是miR-107的靶基因，双荧光素酶报告基因显示miR-107可靶向调控PCDH17，并可负向调控PCDH17表达，进一步研究发现PCDH17在胃癌组织中表达降低，提示miR-107可能通过抑制靶基因PCDH17表达进而促进胃癌发生及发展。

前列腺癌患者血清中PCDH17表达降低，其可作为前列腺癌术后复发的独立预测因子〔15〕。PCDH17甲基化导致其表达水平降低进而促进鼻咽癌、卵巢癌、喉鳞状细胞癌等多种恶性肿瘤发生及发展〔16～18〕。本研究通过上调PCDH17表达，发现胃癌细胞迁移及侵袭能力明显降低，下调PCDH17表达胃癌细胞迁移及侵袭能力明显增强，进一步研究发现PCDH17过表达可促进E-Cadherin表达，而抑制N-Cadherin、Vimentin表达，下调PCDH17表达可抑制E-Cadherin表达，而促进N-Cadherin、Vimentin表达，研究报道指出上调LIM结构域(LMO)1表达可通过促进胃癌细胞发生EMT进而促进细胞迁移及侵袭，EMT主要指机体内上皮细胞转化为间质表型细胞而增强细胞迁移及侵袭能力〔19，20〕。本研究结果证实PCDH17在EMT信号通路中发挥重要调控作用。进一步研究发现上调miR-107表达可逆转PCDH17高表达对MKN-28迁移、侵袭的抑制作用，并可抑制E-Cadherin表达，而促进N-Cadherin、Vimentin表达，提示miR-107表达水平升高可通过抑制靶基因PCDH17表达进而促进胃癌细胞迁移及侵袭，其可能通过促进EMT转化进程而发挥作用。

综上所述，miR-107表达上调可促进胃癌细胞转移，其可能通过抑制靶基因PCDH17表达促使EMT转化而实现目的，为揭示miR-107在胃癌致病机制中的研究提供新思路。但关于miR-107在胃癌发生及发展中的具体作用机制尚存在争议，后续研究将进一步探索miR-107在胃癌致病机制中的调控网络，为胃癌靶向治疗提供潜在靶点。