慢性根尖周炎及慢性牙周炎患者根管内细菌定植

储殷佳 潘加新 陈幸哲 徐玲玲

(常州市第一人民医院口腔科，江苏 常州 213000)

口腔内有大量细菌，细菌之间的相互协同、共生及生物膜形成能力是推动口腔疾病发生发展的主要原因〔1〕。口腔内细菌感染是导致根尖周病与牙髓病发生的主要原因，细菌及其代谢产物可经外伤等刺激导致牙髓暴露并借机直接入侵牙髓组织，引起牙髓组织病变，若早期不及时干预进一步发展将演变为慢性根尖周炎〔2,3〕。位于牙袋内龈下的细菌及其代谢产物是推动慢性牙周炎发生的主要因素，牙周炎发生后这些菌斑细菌将进一步破坏牙周组织，发展到一定程度后患牙将出现松动脱落等情况，对患者的日常生活与工作均有不利影响〔4,5〕。无论是慢性根尖周炎还是慢性牙周炎，其发生与发展均与细菌的入侵息息相关，前者发病多因牙本质小管受到细菌的侵入导致，而牙本质小管受到入侵多与其表面牙骨质及牙釉质破坏导致牙本质小管暴露有关〔6〕。一般根尖周发生慢性炎症后，细菌的代谢产物将经牙本质小管间接作用于牙髓，并进一步侵入侧支根管、牙本质小管及根尖分歧，入侵范围扩大至牙周组织，从而诱发慢性牙周炎〔7〕。由上述论证可知，在慢性根尖周炎与慢性牙周炎整个发病过程中，定植在牙本质小管中的细菌起到决定性作用，由此可见了解慢性根尖周炎与慢性牙周炎患者根管内细菌定植情况对合理药物的选择极为关键〔8〕。本研究旨在了解慢性根尖周炎与慢性牙周炎患者根管内细菌定植情况。

1 对象与方法

1.1一般资料 选取2015年2月至2018年2月常州市第一人民医院就诊的50例牙周疾病患者，研究的实施经院医学伦理委员会同意，患者及其家属对研究知情同意，根据患者不同的感染状态将其分为慢性根尖周炎组(21例)及慢性牙周炎组(29例)。慢性根尖周炎组男14例，女7例；年龄63～75〔平均(68.12±6.51)〕岁；体重45～87〔平均(71.45±6.57)〕kg；受教育程度：初中及以下18例，高中及以上3例。慢性牙周炎组男17例，女12例；年龄60～76〔平均(67.21±6.67)〕岁；体重46～86〔平均(71.56±6.61)〕kg；受教育程度：初中及以下23例，高中及以上6例。

1.2入选标准

1.2.1慢性根尖周炎组 (1)纳入标准：①确诊为慢性根尖周炎，经牙髓电活力测试结果显示无反应；②经X线检查其根尖周投摄影范围直径在3～10 mm；③患牙经根管治疗失败不可保留或已经无保留价值。(2)排除标准：①患牙松动度为Ⅲ度；②接受X线片检查发现其牙槽骨吸收超出根长的1/3；③伴高血压、糖尿病等全身性基础疾病者；④近12 w内使用抗生素治疗者。

1.2.2慢性牙周炎组 (1)纳入标准：①经诊断证实为慢性牙周炎，且疾病程度为重度；②附着丧失>4 mm，牙周袋深度>6 mm；③患者经X线片检查结果显示牙槽骨垂直或水平吸收>2/3根长。(2)排除标准：①同时合并慢性根尖周炎或牙髓病者；②接受X线片检查结果显示患牙的根尖周骨质破坏明显；③合并高血压、糖尿病等疾病；④近12 w内使用抗生素治疗者。

1.3方法

1.3.1材料及试剂 根管内细菌定植检测所用试剂包括：甲醛、柠檬酸三钠、25%戊二醛、碱性品红、甲酸、结晶紫、丙酮苦味酸。所用试剂由上海信帆生物科技有限公司提供；仪器包括日本尼康公司提供的EclipseE200光学显微镜、Coolpix4500照相机、Labaconco冷冻干燥机、HITACHI S-3000N扫描电子显微镜。

1.3.2实验方法 (1)样本准备：拔除患牙后沿患牙根使用锋利凿子由近、远中向将其劈开成两半，使用体积分数为10%的甲醛溶液将其固定，并进行组织学研究，后使用体积分数为3%的戊二醛溶液将另一半固定1 w，并使用扫描电镜仔细观察其变化；(2)制备与观察组织切片：将50%的甲酸与20%的柠檬酸钠以1∶1的比例混合制成甲酸混合液后，将样本放入浸泡4～8 w，待其完全脱钙，经乙醇梯度脱水，石蜡包埋，沿牙长轴进行连续组织切片，组织厚度约5 μm，满意后染色，染色方法为Brown&Brenn法，操作如下：①切片脱蜡；②1%结晶紫染色；③流水冲洗；④卢戈碘液染色；⑤流水冲洗；⑥吸干，丙酮冲洗至无色；⑦流水冲洗；⑧0.25%品红溶液染色；⑨流水冲洗，将水分吸净但无须完全干燥；⑩使用丙酮快速冲洗至少2次，后直接将其放入苦味酸与丙酮的混合液内，直到橙黄色出现为止，后使用丙酮冲洗2次，风干后，滴入二甲苯并使用玻片封盖。所有操作步骤结束后，放置切片于光学显微镜下，经低倍镜至高倍镜仔细观察根管，使用测微尺测量牙本质小管受细菌侵入情况，以牙周侧为主，结果记录并拍照。

1.3.3制备与观察扫描电镜标本 经无菌生理盐水清洗样本，去除表面牙石及软组织，经戊二醛溶液固定，1 w后经乙醇梯度脱水，干燥后在扫描电镜下观察，低倍镜下固定位根管上中下部位及内外侧，经低倍镜至高倍镜观察根管全长，对牙本质小管、根管壁表面及管壁总侧面重点观察，并进一步在高倍镜下对选定区域超微结构自习观察，将结果记录下后拍照。

1.4观察指标 记录两组患者的Brown&Brenn染色结果，比较两组不同感染状态患者的根管内细菌定植阳性检出情况，并对比两组患者的扫描电镜观察结果。

1.5统计学方法 应用SPSS20.0统计学软件行t、χ2检验。

2 结 果

2.1慢性根尖周炎与慢性牙周炎组Brown&Brenn染色结果 慢性根尖周炎患者患牙根管几乎均有细菌定植，根尖1/3段感染最严重，牙本质小管内侧是细菌定植主要集中处，整个牙本质几乎被细菌侵入并贯穿，侵入深度范围：100～1 100 μm，个别患牙牙本质小管外侧(牙周侧)也观察到少量细菌定植。慢性牙周炎组牙本质小管外侧是慢性牙周炎患者细菌定植主要集中部位，即牙周侧，定植深度50～700 μm。此外，在患者牙根表面可见紫染杆状菌、丝状菌聚集成团或成丛，有生物膜样结构形成，仅有个别患牙的牙本质小管内侧可见极少细菌定植。见图1～4。

2.2慢性根尖周炎与慢性牙周炎患者牙本质小管内细菌定植情况

2.2.1牙本质小管各段细菌定植阳性率 经Brown&Brenn染色结果发现，慢性根尖周炎与慢性牙周炎患者均可见牙根表面或根管壁表面附着不同程度细菌，牙本质小管中的不同区域均有细菌定植，且慢性根尖周炎组根冠1/3、根中1/3、根尖1/3牙本质小管内侧细菌定植阳性率均明显高于慢性牙周炎组，根冠1/3牙本质小管外侧细菌定植阳性率明显低于慢性牙周炎组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

RC：根管；DT：牙本质小管；TS：牙根表面；下图同

图2 慢性根尖周炎患者牙本质小管外侧Brown&Brenn染色结果(×200)

图3 慢性牙周炎患者牙本质小管内侧Brown&Brenn染色结果(×200)

图4 慢性牙周炎患者牙本质小管外侧Brown&Brenn染色结果(×200)

表1 两组牙本质小管各段细菌检出阳性情况比较〔n(%)〕

2.2.2不同部位牙本质小管内侧深度细菌定植阳性率 慢性根尖周炎组细菌定植主要集中在牙本质小管内侧，牙本质小管受侵深度最大值为1 100 μm；慢性牙周炎组细菌定植主要集中在牙本质小管外侧，牙本质小管受侵深度最大值为700 μm；慢性根尖周炎组细菌定植侵入深度整体明显高于慢性牙周炎组，差异有统计学意义(P<0.05)；慢性根尖周炎组根冠1/3、根中1/3细菌定植深度明显低于慢性牙周炎组，根尖1/3明显高于慢性牙周炎组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。分析不同侵入深度牙本质小管细菌定植阳性情况发现，在各个部位不同感染状态组患者的各侵入深度细菌定植阳性率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3、4。

表2 两组主要牙本质小管细菌定植部位定植深度比较

表3 慢性根尖周炎组牙本质小管内侧各段不同侵入深度细菌定植阳性分布〔n(%)〕

2.3扫描电镜观察结果

2.3.1慢性根尖周炎扫描电镜观察结果 经扫描电镜观察发现，慢性根尖周炎患者絮状无定形基质中可见大量杆菌、球菌镶嵌，在根管壁上已生物膜形式存在或大量侵入牙本质内，或在呈不规则形态分布在管间牙本质上。见图5。

表4 慢性牙周炎组牙本质小管外侧各段不同侵入深度细菌定植阳性分布〔n(%)〕

2.3.2慢性牙周炎组扫描电镜观察结果 经扫描电镜观察发现，慢性牙周炎患者牙根表面暴露牙本质小管开口处可见不同形态细菌散布或簇集成团，牙本质小管内受到不同程度的侵入。见图6，7。

图5 慢性根尖周炎患者牙本质小管内侧扫描电镜观察结果(×200)

图6 慢性牙周炎患者牙本质小管外侧扫描电镜观察结果(×200)

图7 慢性牙周炎患者牙本质小管外侧扫描电镜观察结果(×200)

3 讨 论

细菌微生物及其代谢产物是导致口腔常见疾病发生的关键原因，这些细菌微生物及其代谢产物可直接经牙本质小管侵入根管内，引起牙髓牙本质复合体发生一系列相应反应，加速牙髓组织炎症破坏；此外，因根管系统与牙周组织相通，故根管内的感染若早期得不到及时的控制极有可能涉及牙周组织，引发慢性根尖周炎、慢性牙周炎等牙周炎性疾病〔9～11〕。

牙本质小管与牙本质基质本身的组成与结构是决定牙本质小管是否受细菌影响关键因素。牙本质本身具有坚硬、渗透性等特质，羟磷灰石Ⅰ型胶原纤维是其主要构成成分，牙齿的不同部位其分布牙本质小管也各异，自牙釉质朝向牙髓，牙本质小管密度的密度由低至高的延伸范围为15 000～45 000 mm2，在牙本质小管密度延伸期间，其与牙髓邻近的一端较粗，与表面越接近则越细〔12～14〕。牙本质小管具有的上述特质均可能是影响细菌在其内部定植的关键因素。健康人群的牙齿表面常有正常量的牙釉质、牙骨质覆盖，且结构完整连续，起到保护牙髓牙本质复合体之效，一旦其受到牙周治疗、外伤等因素影响，原有的保护屏障受到破坏，将暴露牙本质小管，形成与外界相同的开放通路，故细菌定植风险高〔15，16〕。观察既往的研究结果可以看出，尽管在人体口腔内部检出生存细菌超过500种以上，但并未发现任何一种单一的可导致诸如根尖周病、牙髓病等口腔疾病的病原菌，说明上述牙周疾病并不是因单一菌种侵入作用导致，极有可能是多种细菌联合侵入感染后共同参与导致的结果〔17，18〕。

本研究结果显示，慢性根尖周炎患者几乎全部牙本质小管均被细菌侵入，侵入深度较深，侵入范围在100～1 100 μm，细菌定植多集中在根尖1/3段，其根冠1/3、根尖1/3牙本质小管内侧的细菌定植阳性检出率明显高于慢性牙周炎，慢性根尖周炎患者细菌侵入深度可能较慢性牙周炎更深，但各深度范围内细菌的定植情况基本无差别。潘加新等〔10〕研究了慢性根尖周炎患者扫描电镜观察结果发现，患者根尖1/3根管壁及周围聚集细菌，且菌落间有不定形基质样物，以生物膜样结构形式存在，与本研究结果近似。表明慢性根尖周炎患者牙本质小管几乎完全受细菌侵入，且侵入深度较深，易累及其他牙周组织，引发其他诸如慢性牙周炎、牙髓病等疾病，故在治疗时应合理用药保证细菌侵入的控制效果，避免其他牙周组织受影响，降低根尖周炎复发率。

本研究结果发现，慢性牙周炎患者因表面缺失部分牙骨质，为细菌入侵牙本质小管提供条件，且以根冠1/3入侵最为严重，深度最高为700 μm；此外，患者牙根表面可见簇集成团或串的丝状菌及杆菌，其他散在分布菌群则以生物膜样结构存在。后经扫描电镜进一步观察发现，慢性牙周炎患者牙本质小管口大量暴露于患牙牙根表面，可见碎屑及不定形基质，大量以球菌为主的细菌簇集成团，患者牙本质小管深部受细菌侵入明显，且部分牙本质小管内存在胶原纤维排列混乱等情况，此时牙本质小管内部结构被破坏，同慢性根尖周炎比较，二者之间的牙本质小管受细菌入侵情况有明显差异：①慢性牙周炎患者患牙根管细菌定植以根冠1/3为主，慢性根尖周炎则主要为根尖1/3；②细菌定植涉及牙本质小管部位不一，慢性牙周炎主要为牙本质小管外侧，而慢性根尖周炎则主要为牙本质小管内侧。分析二者存在上述差异的原因可能是慢性根尖周炎与慢性牙周炎间的发病机制、病因不同导致，前者的感染源主要来自外伤等因素，在受到外伤等因素影响后，细菌及其代谢产物将诱发牙髓组织产生相应的病理改变，在此过程中，受感染的根管细菌将定植于牙本质小管内；而慢性牙周炎患者感染主要来源于牙周袋龈下菌斑，这些菌斑可通过牙根表面病变的牙骨质直接侵入已经被破坏且暴露的牙本质小管，引起感染，故主要感染根冠，且多定植于牙本质小管外侧〔19～24〕。本研究仅对根管不同感染状态细菌定植情况进行分析，纳入患者仅符合慢性根尖周炎与牙周炎诊断，而对不同疾病类型及牙位等并未进一步区分，加之研究样本量较少，故存在一定局限性，还应在未来增加样本量，采用新型的细菌定量实验，进一步证实不同感染状态下牙本质小管病原菌定植情况存在的差异。