脊髓小脑共济失调3型患者脑脊液及血浆中γ-氨基丁酸和谷氨酸水平检测

姚 静，夏丹豪，杨凌飞，孙亚娟，刘 晗，滕军放

1)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052 2)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052

脊髓小脑共济失调3型(spinocerebellar ataxia type 3, SCA3)是一种常见的常染色体显性遗传性疾病，是多聚谷氨酰胺病之一,临床普遍表现为进行性小脑共济失调[1]。遗传学研究[2-4]显示SCA3患者突变基因位于14号染色体，称为MJD1基因，该基因中的CAG三核苷酸重复片段扩展,使得其编码的Ataxin-3蛋白突变并出现功能异常。神经病理研究[5-6]显示SCA3患者氨基丁酸能神经递质系统存在神经元丢失，齿状核存在γ-氨基丁酸(γ-amino-butylic acid, GABA)A受体丢失。目前，SCA3的发病机制尚未完全明确。有学者[7]提出谷氨酸(glutamate，Glu)在SCA3中起兴奋性毒性作用，但是目前尚无相关神经递质的定量研究。本研究应用超高效液相色谱-质谱联用法检测了SCA3患者脑脊液及血浆中神经递质GABA和Glu的水平，评估其在SCA3疾病发生中的作用，探索SCA3潜在的治疗策略。

1 对象与方法

1.1研究对象募集2017年1月至2019年8月在郑州大学第一附属医院就诊、符合Harding诊断标准[8]，且经基因检测明确诊断的SCA3患者24例(SCA3组)，男9例，女15例，年龄28～62(45.8±10.9)岁，CAG重复次数60～80。所有入组患者均进行国际共济失调评定量表(International Cooperative Ataxia Rating Scale, ICARS)评分[9-10]。同时进行详细问诊以获取相关病史、家族史信息。

正常对照组9例，男3例，女6例，年龄37～64(51.3±8.2)岁，为同期来我院体检的健康志愿者，无神经系统、精神系统异常症状及退行性疾病家族史。本研究获我院伦理委员会批准。

1.2血浆及脑脊液中GABA、Glu水平检测SCA3组患者治疗前晨起空腹取血3 mL，肝素抗凝，静置1～2 h，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上清。正常对照组空腹取血，同上处理。腰椎穿刺由神经内科医师操作，术前均告知具体操作及注意事项，并签署腰椎穿刺知情同意书。抽取脑脊液1 mL，迅速放入液氮冷冻储存。采用蛋白沉淀法处理样品。将冷冻的样品融化取100 μL，并与体积分数75%乙腈、体积分数25%甲醇混合。将该混合物在4 ℃下放置20 min，13 000 r/min离心10 min，取上清，待测。采用超高效液相色谱仪三重四级杆串联质谱仪(沃特世公司)批量测定血浆及脑脊液中GABA、Glu水平。

1.3统计学处理使用GraphPad Prism 8进行统计分析。采用两独立样本t检验比较2组间血浆及脑脊液中GABA、Glu水平的差异，使用Pearson相关分析判别SCA3组血浆及脑脊液中GABA、Glu水平与年龄、CAG重复数及ICARS评分的关系。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组脑脊液及血浆中GABA、Glu水平比较与正常对照组比较，SCA3组脑脊液与血浆中GABA水平较低,Glu水平较高，见表1。

表1 2组脑脊液及血浆中GABA、Glu水平比较 μg/L

2.2SCA3患者脑脊液和血浆中GABA、Glu水平与年龄、CAG重复数及ICARS评分的关系结果见表2。SCA3组CAG重复数为(70.17±5.89)，ICARS评分为(39.1±8.9)。由表2可知，SCA3患者脑脊液中GABA水平与ICARS评分呈负相关，脑脊液和血浆中Glu水平均与CAG重复数呈正相关(P<0.05)。

表2 SCA3患者脑脊液和血浆神经递质水平与临床有关因素的相关系数

*：P<0.05

3 讨论

SCA3突变基因MJD1(染色体14.q32.12;OMIM 109150)基因产物为异常延长的聚谷氨酰胺，过长的聚谷氨酰胺可致Ataxin-3错误折叠，含有错误折叠Ataxin-3神经元的包涵体是SCA3的病理标志物[7]。遗传学及动物研究[11]表明错误折叠的Ataxin-3或其蛋白水解片段对神经纤维蛋白有毒性作用，从而引起病变。SCA3患者的黑质和小脑齿状核受损，脑干中运动核的病变可引起眼球运动和舌无力的复杂紊乱，脑桥萎缩常见，并且在脑桥灰质中最容易发现聚谷氨酰胺阳性神经元核内包涵体；也可见多变的基底神经节、丘脑、脊髓、背根神经节和感觉周围神经的异常[6]。虽然过长的聚谷氨酰胺延伸导致的Ataxin-3错误折叠是SCA3发病的关键因素，但是，该包涵体的存在与组织破坏程度并无明显直接关系，该疾病神经病理学的复杂性仍然在很大程度上无法解释。

GABA是一种主要的抑制性神经递质，其可以激动GABAA、GABAB和GABAC受体。病理学研究[5-6]显示SCA3患者氨基丁酸能神经递质系统有神经元丢失和GABAA受体丢失。SCA3患者小脑齿状核、小脑上脚、小脑中脚存在萎缩改变，其中浦肯野细胞萎缩明显，其神经元周围有葡萄状簇形成，且免疫组化证据支持GABA能突触末端呈增殖改变[6,12]，可能为代偿性增殖。此外，有研究[13]显示应用GABA转运体抑制剂可导致癫痫患者出现共济失调，小脑中GABA能神经元的消融也会导致共济失调。本研究结果显示，SCA3患者血浆及脑脊液中GABA水平较正常对照低，表明SCA3患者共济失调的部分原因可能是GABA水平下降。

Glu是人脑内最丰富的游离氨基酸并参与多种代谢途径，其对神经细胞具有兴奋作用，是哺乳动物中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质。它可作用于脑细胞表面存在的谷氨酸受体，激发细胞死亡。但是正常情况下，体内强大的摄取系统(谷氨酸转运蛋白)可通过从大脑细胞外液中连续去除谷氨酸，防止这些受体的过度活化[14]。进一步研究[7]显示，Glu左旋体可诱导Ataxin-3形成难溶性聚集体，进一步导致相关病理改变。本研究结果显示，SCA3患者血浆及脑脊液中Glu水平较正常对照高，为Glu的兴奋性毒性作用提供了证据。

ICARS是对姿势和姿势障碍、肢体共济失调、构音障碍以及动眼障碍的定量评估，该量表可评估SCA3病情的严重程度[10]。本研究发现SCA3患者脑脊液中GABA水平与ICARS评分呈负相关，表明SCA3患者脑脊液中GABA水平可反映患者共济失调严重程度。此外，本研究中SCA3患者脑脊液与血浆中Glu水平与CAG重复数呈正相关，推测CAG重复长度可在一定程度上影响患者体内Glu的水平。

综上所述，SCA3患者脑脊液及血浆中GABA水平降低，Glu水平升高；脑脊液中GABA可反映SCA3患者病情严重程度。提高患者体内GABA或者降低Glu水平或可能作为SCA3治疗的研究方向。限于本研究样本量较小，GABA和Glu水平改变及其临床意义有待扩大样本量进一步研究。