非小细胞肺癌患者外周血中HIF-1α+MDSC比例对低氧条件下CD8+T细胞杀伤活性的影响

李洁瑶，张 毅，王丽萍

1)郑州大学第一附属医院肿瘤中心 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心 郑州 450052

缺氧微环境在实体肿瘤的发展过程中发挥重要作用，涉及各种转录因子的活化以及多种复杂信号通路的调控[1]。肿瘤生长速度过快将导致多数实体瘤内部产生大面积缺氧区，在这个过程中，氧感应器低氧诱导因子-1α (hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)由于应答缺氧状态会引起肿瘤微环境发生变化，从而促进肿瘤细胞为了存活做出适应性改变，如活化血管内皮生长因子以促进肿瘤血管生成[2]。髓源抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)是一群异质性细胞群体，可以从功能和表面标记物两方面进行区分和鉴别[3-4]。MDSC主要发挥免疫抑制作用，在肿瘤患者体内表现为抑制效应T细胞增殖和功能、促进肿瘤细胞繁殖和耐药，从而促进肿瘤生长[5-6]。

肺癌的发病率和死亡率在全球癌症中居首位;肺癌中约80%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，大部分NSCLC患者确诊时已处于中晚期或者晚期，失去手术机会，其中近3/4的患者需要接受姑息性放化疗[7]。本研究采集NSCLC患者外周血，检测HIF-1α+MDSC的比例，分析其与患者临床病理指标和疗效的关系，以及HIF-1α+MDSC对CD8+T细胞杀伤活性的影响。

1 对象与方法

1.1研究对象NSCLC患者35例, 均为2018年1月至12月郑州大学第一附属医院肿瘤科经病理学确诊的住院患者。35例中男22例，女13例；年龄32～75岁，其中<65岁7例，≥65岁28例；肿瘤大小：T1～2 22例，T3～4 13例；19例无淋巴结转移；临床分期：Ⅰ+Ⅱ期22例，Ⅲ+Ⅳ期13例；分化程度：高分化8例，中分化13例，低分化14例。35例之前均未接受过任何抗肿瘤治疗，KPS评分>70分，预计生存期>3个月。健康供者29名(正常对照)，年龄32 ～75岁，中位年龄55岁；男20名，女9名。

1.2主要试剂和仪器FITC标记的CD3单抗、PE标记的CD8单抗、FITC标记的颗粒酶B单抗、APC标记的穿孔素单抗、APC标记的HIF-1α单抗、FITC标记的CD33单抗、AE标记的CD124单抗、APC-Cy7标记的CD14单抗、PE-Cy7标记的CD11b单抗、Percp标记的7AAD单抗及同型抗体均购自BD Pharmingen公司。CD8、CD14和CD11b磁珠均购自德国美天旎公司。超净工作台购自珠江市再鑫仪器有限公司，离心机购自Thermo Scientific公司，流式细胞仪购自BD Biosciences公司。

1.3外周血中相应细胞比例检测无菌条件下抽取NSCLC患者与健康供者外周血6 mL(EDTA抗凝)，在6 h内，采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)。调整PBMC密度至1×106个/mL，避光加入免疫荧光抗体或相应同型抗体，混匀后室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测CD14+CD11b+细胞(M-MDSC)、CD14-CD11b+细胞(G-MDSC)、HIF-1α+MDSC、CD33+MDSC及CD124+MDSC等细胞的比例。

1.4NSCLC患者HIF-1α+MDSC对低氧条件下正常CD8+T细胞杀伤活性的影响根据目的细胞在总细胞液中的比例以及最终所需细胞量，大致计算出需要分选的PBMC总数，依次加入CD8磁珠、CD14磁珠和CD11b磁珠，分离出某一健康供者CD8+T细胞和患者G-MDSC、M-MDSC。取健康供者CD8+T细胞，分为6组，低氧组、低氧+抑制剂组、低氧+G-MDSC1组、低氧+G-MDSC2组、低氧+G-MDSC1+抑制剂组、低氧+G-MDSC2+抑制剂组。6组均用100 mol/L CoCl2诱导低氧培养环境，低氧+G-MDSC1组和低氧+G-MDSC2组CD8+T细胞和G-MDSC分别按1∶1和1∶4共孵育；低氧+抑制剂组、低氧+G-MDSC1+抑制剂组和低氧+G-MDSC2+抑制剂组在以上处理基础上加入HIF-1α抑制剂(10 μmol/L MeOE2)。共孵育72 h后收集各组细胞，采用流式细胞术检测CD8+T细胞分泌颗粒酶B和穿孔素水平。另取健康供者CD8+T细胞分为6组，即低氧组、低氧+抑制剂组、低氧+M-MDSC1组、低氧+M-MDSC2组、低氧+M-MDSC1+抑制剂组、低氧+M-MDSC2+抑制剂组，同上处理。

1.5治疗及疗效评价所有NSCLC患者均采用以铂类为基础的两药联合化疗方案治疗4周期，每2周期评价一次疗效。疗效评价按照WHO制定的实体瘤客观疗效评定标准[8]分为：完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)和进展(PD)。化疗疗效以PR为好转、SD+PD为未好转分为2组。

1.6统计学处理采用SPSS 17.0处理数据。NSCLC患者和正常对照外周血中HIF-1α+MDSC比例的比较采用两独立样本t检验，HIF-1α+MDSC比例与CD33和CD124表达水平的相关性采用线性相关分析,HIF-1α+MDSC比例与NSCLC患者疗效的关系采用χ2检验分析，HIF-1α+MDSC比例与NSCLC患者临床参数的关系采用单因素方差分析或两独立样本t检验分析，不同孵育比例和有无HIF-1α抑制剂对CD8+T细胞分泌颗粒酶B和穿孔素水平的影响采用2×3析因设计的方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组外周血中HIF-1α+MDSC比例的比较NSCLC患者外周血中HIF-1α+G-MDSC和HIF-1α+M-MDSC比例均高于正常对照(表1)。

表1 2组外周血中HIF-1α+MDSC比例比较 %

2.2NSCLC患者HIF-1α+MDSC比例与其表面CD33和CD124含量的相关性HIF-1α+G-MDSC比例与其表面CD33和CD124比例呈正相关，HIF-1α+M-MDSC比例与CD33比例呈正相关(表2)。

表2 NSCLC患者HIF-1α+MDSC比例与其表面CD33和CD124比例的相关性

表中为r(P)

2.3不同临床参数和疗效NSCLC患者外周血HIF-1α+MDSC比例比较NSCLC患者外周血中HIF-1α+MDSC比例与肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期、分化程度有关，见表3。35例NSCLC治疗后均无CR病例。NSCLC患者以正常对照组HIF-1α+MDSC比例均值为界，HIF-1α+MDSC比例>11.0%为高比例组，≤11.0%为低比例组。35例患者中HIF-1α+MDSC比例高者19人，治疗后6人好转，比例低者16人，治疗后12人好转，HIF-1α+MDSC比例低者预后较好(P=0.018)。

2.4不同条件下NSCLC患者HIF-1α+MDSC对正常CD8+T细胞杀伤活性的影响结果见表4～7。结果显示，NSCLC患者的HIF-1α+G-MDSC和HIF-1α+M-MDSC均可抑制正常CD8+T细胞分泌颗粒酶B和穿孔素的能力，即抑制CD8+T细胞的杀伤活性，其抑制作用呈一定的剂量依赖性。

表3 HIF-1α+MDSC比例与NSCLC患者临床参数的关系

表4 不同条件下HIF-1α+G-MDSC对正常CD8+T细胞分泌颗粒酶B水平的影响

F孵育比例=15.670，P<0.001;F抑制剂=34.290,P<0.001;F交互=1.560，P=0.223

表5 不同条件下HIF-1α+G-MDSC对正常CD8+T细胞分泌穿孔素水平的影响

F孵育比例=6.960，P=0.012;F抑制剂=37.000,P<0.001;F交互=2.150，P=0.130

表6 不同条件下HIF-1α+M-MDSC对正常CD8+T细胞分泌颗粒酶B水平的影响

F孵育比例=7.480，P=0.009;F抑制剂=28.510,P<0.001;F交互=1.040，P=0.362

表7 不同条件下HIF-1α+M-MDSC对正常CD8+T细胞分泌穿孔素水平的影响

F孵育比例=6.400，P=0.015;F抑制剂=49.850,P<0.001;F交互=0.700，P=0.502

3 讨论

大多数NSCLC患者确诊时已达中晚期，失去手术根治的机会，既往化疗是主要治疗手段。化疗抑制肿瘤增长、减轻肿瘤负荷的效率相对较低，且不良反应多，如粒细胞减少、末梢神经炎、脱发、疲乏和关节痛等[9]。随着医学研究的发展，靶向治疗和免疫治疗逐渐成为晚期肿瘤患者的首选治疗方案。但靶向治疗的缺陷在于快速耐药，一代EGFR-TKIs平均耐药时长约为6个月，而免疫治疗，如PD-1单抗，仍有30%～50%患者对其无应答[10-11]。因此，寻找敏感靶点、提高肿瘤治疗的有效率已成为迫在眉睫的问题。

MDSCs作为免疫抑制细胞，在抗肿瘤免疫中的作用日益被重视，许多针对其靶向治疗的研究正在展开，明确MDSCs发挥功能的具体分子机制或途径将极大提高治疗的准确性和效率，同时降低不良反应。

本实验采用流式细胞术对35例NSCLC患者和29例正常对照外周血中HIF-1α+G-MDSC和HIF-1α+M-MDSC比例进行检测，结果显示，NSCLC患者外周血中HIF-1α+G-MDSC和HIF-1α+M-MDSC比例均高于正常对照。其中，HIF-1α+G-MDSC比例与MDSCs表面CD33和CD124比例呈正相关，HIF-1α+M-MDSC比例与其表面CD33比例呈正相关。白介素-4受体(IR-4R)即CD124被认为是MDSCs的功能性表面标记物。研究[12-13]证明，IL-13/IL-4R通路从多方面调节M-MDSC功能；将外源性IL-13转入健康人M-MDSC中可以促使MDSC活化为免疫抑制细胞，中和IL-4R 可以逆转MDSC的免疫抑制功能。此外，本研究结果还显示，临床分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移及肿瘤分化程度低的患者外周血中HIF-1α+G-MDSC和HIF-1α+M-MDSC比例高于临床分期Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移及肿瘤分化程度高者。另外，HIF-1α+MDSC比例高的NSCLC患者化疗疗效差，比例低者则化疗疗效好。

研究[14-15]表明，肿瘤患者MDSCs表面HIF-1α比例显著升高，在促进肿瘤增长过程中发挥重要作用。因此，恶性肿瘤患者体内的肿瘤微环境中HIF-1α+MDSC可能发挥重要抑制功能[16]。本研究结果显示，HIF-1α+G-MDSC和HIF-1α+M-MDSC均可抑制CD8+T细胞分泌颗粒酶B和穿孔素的能力，即抑制CD8+T细胞的杀伤活性，其抑制作用呈一定的剂量依赖性；HIF-1α抑制剂可增强CD8+T细胞分泌颗粒酶B和穿孔素的能力，即增强CD8+T细胞的杀伤活性。

综上所述，在NSCLC患者中HIF-1α+MDSC比例高于正常对照组，其比例高低与临床分期、淋巴结转移及分化程度有关，且比例高者疗效更差。体外实验证实，HIF-1α+MDSC可降低CD8+T细胞的杀伤活性，造成免疫抑制，因此，HIF-1α+MDSC可作为评价预后的指标及肿瘤治疗的新靶点。