乙酰化纳米纤维素淀粉复合膜的制备及性能

王利军，张梦阳，彭娟，翁梦苓，陈健，梁玲玲，聂双喜，朱雯君，姜言*

(1.广西大学 轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004；2.广西农业科学院甘蔗研究所，广西 南宁 530007；3.农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室，广西 南宁 530007；4.广西广业贵糖糖业集团有限公司，广西 贵港 537102； 5.广西农业科学院，广西 南宁 530007)

0 引言

现如今，以塑料为基质材料的食品包装材料对人们的生活环境造成了严重的威胁，这一类的包装材料在自然界中难以降解，因此开发一种以生物基为材料的包装材料是当今世界的急切需求。生物基材料来源广泛、是一种绿色环保的可再生可降解材料。目前，国内外研究学者在生物基抗菌包装材料方面已经开展了较多研究[1]。

淀粉在自然界中储量丰富，具有良好的成膜性，是一种具有巨大利用价值的绿色高分子材料。自从1951年Wolff等率先使用淀粉这一材料制备了可降解的生物膜，以淀粉基为基础的包装材料在国内外引起了极大的关注[2]。但淀粉基膜仍存在力学性能差、容易老化、阻水性能较差、对环境湿度较敏感等缺点[3]。将淀粉或变性淀粉与天然物质(如纤维素、明胶、蛋白质等)或非天然物质(如聚乙烯醇)复配，并加入一定的交联剂和乳化剂，制备出多功能、可降解、高性能的淀粉复合膜是近年来的主要研究方向[4-7]。

纳米纤维素(cellulose nanofibril, CNF)的来源于地球上丰富的纤维资源，具有比表面积较大、机械性能好、热稳定性较强以及绿色环保等特点，是复合材料理想的增强相。但是有大量亲水性的羟基结构存在于纳米纤维素表面，使得纯CNF膜的耐水性能较差。通过表面吸附、酯化改性、接枝共聚和乙酰化等方法可以提高纳米纤维素的疏水性[8]，通过乙酰化改性在改善CNF疏水性的同时可以提高CNF的分散性，乙酰化CNF作为增强相，可显著提升淀粉膜的阻水性能，并且增加淀粉膜的机械性能。

乳酸链球菌肽(Nisin)是一种由乳酸链球菌分泌的多肽抗菌素，是一种天然的食物防腐剂[9]，对革兰氏阳性菌有很强的抑制生长作用[10]。在本研究中，通过对CNF进行乙酰化改性得到乙酰化纳米纤维素(ACNF)，然后将ACNF加入到淀粉膜中从而达到增强其力学性能和疏水性能的目的，制备出性能更为优良的ACNF-ST复合膜，再将乳酸链球菌肽加入到ACNF淀粉膜中，从而制备出一种可生物降解的生物抗菌膜。

1 材料和方法

1.1 原料与试剂

甘蔗渣漂白浆板(广西贵糖糖业基团有限公司)，氢氧化钾、乙酸酐、无水乙醇、冰乙酸、亚氯酸钠(天津科密欧化学试剂有限公司)，氯化1-丁基-3-甲基咪唑(上海成捷化学有限公司)。

木薯淀粉(北京酷来博生物科技有限公司)，甘油(上海麦克林有限公司)，氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)，无水氯化钙(天津市大茂化学试剂厂)，乳酸链球菌肽(洛阳奇泓生物科技有限公司)，胰蛋白胨(北京陆桥技术有限责任公司)，酵母浸膏(生工生物工程上海股份有限公司)，琼脂(北京陆桥技术有限责任公司)，以上原料、试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HHS-204电动恒温磁力水浴锅(上海博讯实业有限公司)，MKZA10-15JIV超微粒粉碎机(日本増幸产业株式会社)，GJJ-0.06/40高压均质机(温州科巨流体设备制造有限公司)，DF-101S恒温磁力加热搅拌器(巩义市予华仪器有限公司)，Alpha 1-2 LD Plus真空冷冻干燥器(德国Christ公司)，D-45473标准浆料疏解机(德国Estanit GmbH公司)，VERTEX 70傅里叶红外光谱仪(德国布鲁克公司)，SMARTLAB 3KWX射线衍射仪(日本株式会社理学公司)，STA 449 F5同步热分析仪(德国耐驰仪器公司)，3367万能材料试验机(美国英斯特朗公司)，HJ-4A数显恒温磁力搅拌器(江苏金怡仪器科技有限公司)，DSA100吕克士接触角测量仪(荷兰飞纳公司)，Lambda950紫外分光光度计(美国珀金埃尔默仪器有限公司)，GNP-P080恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)，SW-CJ-1D超净平台(苏州净化设备有限公司)，DSX-280B高压灭菌锅(上海申安医疗机械厂)。

1.3 方法

1.3.1 CNF的制备

先将蔗渣漂白浆中的半纤维素去除，需要向其加入质量分数为5 %的KOH溶液，放置在恒温水浴中，设定温度为90 ℃，持续反应2 h。待反应结束后，将漂白浆不断同去离子水冲洗，直至反应后的物质的pH为中性。把30 %亚氯酸钠溶液加到去除半纤维素的浆液中，用CH3COOH调节pH，直至pH到4～5，放置在恒温水浴中，设定温度为75 ℃，持续反应2 h。将蔗渣漂白浆去除，用去离子水洗涤，直至中性，除去残余木素。

向浆液中添加去离子水，浆液和去离子水的质量比为1∶49，用疏解机处理30 min。然后将稀释后的浆液放入盘磨机中，调整盘磨距离为-100 μm，转速为1 500 r/min，研磨1 h。完成后，将浆料浓度进一步稀释为质量分数为0.2 %，倒入高压均质机中进行均质，先将均质机的压力调整为40 MPa，高压均质10次，再将均质机的压力调整为60 MPa，高压均质5次，得到纳米纤维素。

1.3.2 ACNF的制备

为获得非均相改性的纳米纤维素，取浓缩后干燥质量为1.0 g的CNF，加入20 mL CH3COOH对纳米纤维素进行活化润胀，活化时间为1 h，然后对反应进行超声处理，处理时间为10 min。按Ac2O(mL)∶CNF(g)为2∶1的比例，将2.0 mL的Ac2O加入其中，并加入硫酸0.05 mL催化反应，在50 ℃下反应1 h。待反应完成后，将反应后的溶液冷却到室温，加入一定量的C2H5OH，待出现白色的沉淀物质后进行真空抽滤，并用去离子水洗涤直至中性[11]。将反应完全的ACNF放在真空冷冻干燥机中，直至完全脱去水分。

1.3.3 淀粉复合膜的制备

制备纯淀粉膜:淀粉2.9 g，去离子水125 mL，甘油0.87 g，放在85 ℃恒温水浴中，磁力搅拌0.5 h。待淀粉糊化，在室温条件下不断搅拌20 min，搅拌完成后倒进模具中，放置在60 ℃的条件下，制成纯淀粉膜。

CNF-ST复合膜的制备：在纯淀粉膜的制备材料中再加0.1 g的CNF，其余操作同纯淀粉膜的制备，制得CNF淀粉复合膜。

ACNF-ST膜的制备：向纯淀粉膜的制备原料中再加0.1 g的ACNF，其余操作同纯淀粉膜的制备，制得ACNF-ST复合膜。

复合制剂的抗菌膜:淀粉2.6 g、甘油0.78 g、ACNF 0.1 g、125 mL的去离子水，搅拌在85 ℃恒温水浴0.5 h，淀粉凝胶化，增加溶液冷却到0.3 g链球菌，于常温下，在磁力搅拌中0.5 h，倒入定制好的模具中，待自然风干后，将膜揭出，得到制备的复合膜。

1.3.4 样品表征与测试

1.3.4.1 红外光谱分析

分析试样的仪器为傅里叶变化红外光谱，得到试样的红外吸收光谱。试样干燥后，与KBr混合均匀，按1∶100的比例研磨，直至成粉末，倒入模具，向模具施加约10 MPa的压力，制得完全透明的压片，然后用仪器分析样品[12]。

1.3.4.2 ACNF取代度的测定

取冻干的ACNF 0.1g，放在100 mL的锥形瓶中，添加20 mL的C2H5OH，在50 ℃的温度下冷凝回流，反应时间30 min。然后再加入20 mL 0.1 N的NaOH溶液，50 ℃的温度下冷凝回流，反应时间15 min。反应结束后塞紧瓶塞。在室温下放置48 h后，向其中滴加酚酞，用0.1 N的盐酸溶液滴定。记录盐酸所用的体积，作为空白对照的是氢氧化钠溶液。取代度的计算公式如下[13-14]：

(1)

(2)

式中：V1为在氢氧化钠空白对照下试样所用盐酸的体积,mL；V2为在ACNF试样下所用盐酸的体积,mL；m为ACNF样品质量,g；CHCl为盐酸的浓度,mol/L。

1.3.4.3 热重分析

用德国耐驰仪器公司的同步热分析仪测定了试样的热稳定性。向氧化铝坩埚中放入10 mg的试样，在氮气的保护下升温，温度从30 ℃提高到600 ℃，升温速率为10 ℃/min，氮气流速为20 mL/min。

1.3.4.4 机械性能测试

按照GB/T 1040.3-2006中的测定方法，得出了试样薄膜的拉伸强度和断裂伸长率[15]。在恒温恒湿箱中将环境调为RH=53 %，将试样薄膜放置72 h，然后样品膜裁成1 cm×10 cm厚度均匀的长方条状，测定时仪器进行拉伸的速度为5 mm/min，初始夹距为50 mm，进行五组平行实验。对测定的数据取平均值。拉伸强度和断裂伸长率的计算公式如下：

(3)

式中,σ为拉伸强度，MPa；F为最大应力，N；S为有效面积，mm2。

(4)

式中：E为断裂伸长率，%；ΔL为断裂时伸长量，mm；L为最初长度，mm。

1.3.4.5 吸水性能分析

按照GB/T 1034—2008检测试样的吸水性能。将试样制为直径60 mm的圆，放在温度为60 ℃的烘箱，干燥24 h。从烘箱中取出后，放置在在干燥器中冷却，当温度降低至室温时称重，将试样放置在饱和NaCl溶液中，体系的相对湿度为75 %，每隔24 h称取一次重量，直到不再改变。吸水率的计算公式如下：

(5)

式中：WA为试样的吸水率，%；W1为吸水后试样的质量，g；W0为吸水前试样的质量，g。

1.3.4.6 水蒸气透过性能

水蒸气透过率的测定方法采用GB 1037—70。将试样膜切成直径为60 mm的圆，将样品放置在温度为25 ℃，相对湿度为50 %的恒温恒湿箱中进行平衡。称取质量为5 g无水CaCl2，放在称量瓶中，在称量瓶口封好平衡样膜，将试样置于饱和NaCl溶液中，体系的相对湿度为75 %，每经过一段时间后称取一次重量。水蒸气透过系数的计算公式如下：

(6)

式中，WVP为水蒸气透过系数，g·mm/(m2·h·KPa)；Δm为转移的水蒸气量，g；d为试样的厚度，mm；A为试样的面积，m2；t为测试时间，h；ΔP为试样两边的蒸气压差，kPa。

1.3.4.7 接触角分析

按照GB/T 30447—2013测定试样的接触角，取平整部分的复合膜裁剪成长条状，在60 ℃的温度下干燥12 h，在室温下黏贴在玻璃平板上，使表面均匀。本仪器采用活塞自动注射器检测压样膜表面的去离子水滴[18-19]。检测了去离子水和样品表面之间接触角。对样品进行了5次平行实验，得到了薄膜的疏水角度。

1.3.4.8 光学性能

按照GB 2410—2008中的光学性能的测试方案，采用紫外-分光光度计对膜的透明度进行检测[20]。将复合膜切成40 mm×10 mm的条状，置于比色皿中，贴附于皿内壁，不起泡、不皱褶。将样品在600 nm的波长处测量，做3个平行实验[20]。透明度的计算公式如下：

T=10-A，

(7)

式中：T为试样的透明度，%；A为试样的吸光度。

1.3.4.9 抗菌实验

按照QB/T 2591—2003测定试样膜的抗菌性能，抑菌环法可以测定复合膜是否具有抑制菌生长的效果。选取斜面培养的革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)。实验前，首先对菌种进行活化，选择单一菌落作为培养菌。接种在培养基中，培养时间为24 h，对菌液进行梯度稀释。将菌液用生理盐水进行稀释，直至稀释到浓度为105，进行抑菌实验[21]。

将直径为2.5 cm的无菌滤纸放入膜液中，放入无菌蒸馏水中的是空白对照组，在无菌蒸馏水中放置5 min，然后取出来在室温下进行风干，将培养箱的温度设置为37 ℃，将涂布金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的培养皿放在培养箱中，培养24 h。每组平行进行3个平行实验，取平均值。

2 结果与分析

2.1 ACNF的化学结构和扫描电镜分析

(a) 红外光谱

(b) ACNF的取代度

图2中展示了CNF和ACNF的扫描电镜图。经冷冻干燥处理后，由于 CNF表面存在大量的氢键相互作用，CNF发生了明显的团聚现象，产生了部分纤维束，因此，CNF的分散性较差。而对于ACNF，乙酰化改性取代了纤维素表面的羟基结构，使得纤维素上的羟基含量降低，提高了纤维素的疏水性，使得ACNF之间的氢键相互作用力降低，因此，ACNF经干燥后，团聚现象较少，分散性能更好。

(a) CNF的扫描电镜图

(b) ACNF的扫描电镜图

2.2 吸水性能分析

复合膜的水接触角从图3(a)可以看出。CNF-ST的水接触角大于ST的接触角，说明ST中引入CNF后导致疏水性提高了。相比CNF-ST，ACNF-ST的水接触角进一步增加，而且随着ACNF取代度的提高，ACNF-ST的水接触角呈现增加的趋势，这是因为ACNF的疏水性相比CNF更佳，在ST中加入ACNF后能够显著提高复合膜的疏水性[24]。复合膜的水蒸气透过系数如图3(b)所示，相比ST，CNF-ST的透湿性增加了0.211 4 g·mm/(m2·h·KPa)，这可能是由于CNF-ST相比ST孔隙率更高，水分子透过路径增多，导致膜透湿系数增大[18]。ACNF-ST的透湿性相比CNF-ST较低，这主要是由于乙酰化改性可以降低CNF的自聚现象[22]，使得ACNF分散的更为均匀，成膜更加均一。而ACNF-ST的透湿性随着ACNF乙酰基取代度的增加先降低后升高，其中ACNF-2-ST的透过系数最低，一方面是由于低取代度下的ACNF表面疏水性增强，吸水性减少；另一方面是在高取代度下，高疏水性的ACNF和淀粉之间界面作用力减少，使得膜的孔隙率上升，导致膜对水的吸收增强。这些数据表明，乙酰化是改变淀粉膜吸水率的有效方法。

复合膜的吸水性能如图3(c)所示。在ST中引入ACNF能够很明显的降低复合膜的吸水性。而且伴随着ACNF乙酰基取代度的不断升高，复合膜的吸收性不断下降。经过40～80 h后，ACNF-ST的吸水率达到平衡状态，其中ACNF-1-ST、ACNF-2-ST、ACNF-3-ST、ACNF-4-ST的吸水率分别为18.56 %、17.43 %、16.41 %、15.73 %，与ST相比，分别降低了1.26 %、2.39 %、3.41 %和4.09 %。这主要是由于ACNF表面疏水性的乙酰基能够显著提升复合膜的疏水性[8]。因此，在ST中引入ACNF是一种增加复合膜阻水性能的有效方法。

(a) 复合膜的接触角

(b) 复合膜的水蒸气透过性能

(c) 复合膜的吸水率

2.3 透光性和热稳定性分析

复合膜的TGA曲线和DTG曲线如图4(a)和图4(b)所示，相比纯淀粉酶，复合膜的热降解温度略大，并且不同改性程度的ACNF-ST之间的热稳定性差异不大。由图可以看出最大热降解温度的是CNF-ST，为335.5 ℃，大于ST的314.5 ℃。虽然ACNF-1-ST、ACNF-2-ST、ACNF-3-ST、ACNF-4-ST样品的最大热降解温度在322 ℃左右，小于CNF-ST，复合膜中含有大量的淀粉，而CNF和ACNF-1、ACNF-2、ACNF-3、ACNF-4的用量较少，使得它们差别不大，但是从数据中可以知道，向淀粉中加入ACNF，可以使得复合膜的热稳定性有增加的趋势。

透明度是反映膜表观光学性能的重要指标。从图4(c)可以看出，ST拥有最高的透明度，为83.7 %。加了CNF或是ACNF后，复合膜透明度都有所下降。这是因为CNF可以填补淀粉颗粒和增塑剂甘油之间的间隙，从而减少复合膜中光折射[25]，因此复合膜的透明度低于纯淀粉膜。向ST中加入ACNF后，由于ACNF取代度的增加导致ACNF-ST的透明度有所增加，这是因为ACNF增加了纳米颗粒的分散性，使其分布得更加均匀[8]。因而随着取代度的升高，更多的羟基结构被取代，ACNF分散得更加均匀，使得膜具有更好的均一性，同时使得ACNF-ST的透明度呈现升高的趋势。随着乙酰化的进行，ACNF-4-ST的透明度增加了7.6 %，为72.3 %。综上，可以得出结论：适度的乙酰化改性可以提高纳米纤维素淀粉复合膜的透明度。

(a) 复合膜的TGA曲线

(b) 复合膜的DTG曲线

(c) 复合膜的光学性能

2.4 力学性能分析

从图5中可以看出，与纯淀粉膜相比，ACNF-ST的拉伸强度提高了244.2 %。经过机械研磨之后，CNF具有更大的比表面积，在纤维的表面有更多的羟基结构。相邻的淀粉与羟基形成了牢固的氢键，从而使得CNF-ST有更好的力学性能[26]。在加入ACNF后，ACNF-ST的拉伸强度呈现减小的趋势，其中ACNF-2-ST的拉伸强度最好。CNF上的羟基由于乙酰化的进行而不断减少，导致拉伸强度下降。而乙酰化反应使得ACNF具有更好的分散性，抑制了纤维与纤维之间的团聚[8]。在低取代度下，ACNF-1分散性较差，相比ACNF-2更容易团聚，因此ACNF-2-ST具有更好的机械性能；随着乙酸酐用量的不断增加，纳米纤维素的晶体结构遭到破坏，更多的晶体结构变为无定形曲，从而影响了膜的机械性能[22]。因此，随着取代度的增大，ACNF-ST的拉伸强度出现了一种先增加后减少的趋势，在纳米纤维素和乙酸酐的比例为1∶2时，拉伸强度最好。

图5 复合膜的力学性能Fig.5 Mechanical properties of composite film

淀粉膜的断裂伸长率大于CNF，这是由于CNF具有更强的抗拉强度和更强的刚性和脆性。此外，复合膜中CNF-ST和ACNF-ST的断裂伸长率低于淀粉膜的断裂伸长率，这是因为复合膜中的纳米纤维素限制了淀粉基质的链运动[27]，使得复合膜的延展性有所减少。由于乙酰化反应的不断进行，CNF上的羟基被不断的取代，CNF的表面结构发生变化，刚度下降，从而导致CNF的断裂伸长率有所增加。但在过高的取代度下，乙酰化反应会严重损伤纤维结构，因此容易断裂。随着取代度的增加，断裂伸长率呈现出一种先增大后减小的趋势。当CNF和AC的比例为1∶2时，断裂伸长率最佳。

因此，在一定的取代度下，纤维结构保存完好，取代度增大，分散更好，ACNF与淀粉能够更加均匀的结合在一起，当取代度增加的时候，ACNF-ST的拉伸强度和断裂伸长率也随之增加。当过度的乙酰化破坏纤维素的结构时，随着乙酰化的进行，CNF的取代度随之增加，这导致了纤维素断裂伸长率和拉伸强度的减少。因此，在CNF和AC的比例为1∶1的情况下，ACNF-2-ST的力学性能优于ACNF-2-ST。

2.5 抗菌性能分析

通过前期实验，筛选出力学性能和耐水性能最好的复合膜(ACNF-2-ST)，并加入10 %的Nisin制备抗菌膜。从图6可以看出，f1上被大肠杆菌覆盖，没有出现大肠杆菌的抑菌圈，g1上长满了金黄色葡萄球菌，没有抑菌圈；用含10 %Nisin的膜液浸泡过的滤纸片的平板f2、g2上出现了大小不一的抑菌圈。在用游标卡尺测量后可以得知，f2的抑菌圈直径为2.85 cm，g2抑菌圈直径为2.90 cm。从图6中可见，含Nisin的复合膜金黄色葡萄球菌的抑菌作用比大肠杆菌的明显，说明含Nisin的复合膜对革兰氏阳性菌具有更好的抑菌效果。

图6 含Nisin复合膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果(f1、g1:0 %Nisin，f2、g2：10 %Nisin)Fig.6 Inhibition of composite film containing Nisin on Escherichia coli and Staphylococcus aureus(f1、g1:0 %Nisin，f2、g2：10 %Nisin)

3 结论

① 不同取代度的ACNF能够显著改善ST膜的性能。ACNF在淀粉膜中能够均匀分散使得ACNF-ST复合膜具有较好的耐水性能和透光率。控制ACNF的乙酰基取代度对提升ACNF-ST复合膜的耐水性能具有重要意义，当ACNF的乙酰基取代度为0.27时，ACNF-ST复合膜的耐水性能最佳，在ST膜中引入ACNF能够提升ST的热稳定性。引入ACNF显著提升ST的拉伸强度，但在一定程度上降低了ST的断裂伸长率。当CNF和AC的质量比为1∶2，ACNF的乙酰基取代度为0.27时，ACNF-ST复合膜表现出较优的综合力学性能。

② ACNF-ST-Nisin复合膜的具有一定的抗菌效果，且相比革兰氏阴性菌，对革兰氏阳性菌的抑菌作用更强。综上所述，所制备的ACNF-ST-Nisin复合膜具有良好的力学性能、疏水性、热稳定性和抗菌性能，为开发一种绿色环保的新型生物基包装材料提供了新的思路。