SOX9在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞HGC-27生物学功能的影响*

文洁，韩书山，陈志，杨梦婷，邵泽伟，王思伟，山凤莲

(1.济宁医学院 a.临床医学院，b.法医学与检验医学院，山东济宁 272013；2.江苏大学医学院细胞生物学教研室，江苏镇江 212000；3.济宁医学院附属医院呼吸内一科，山东济宁 272029)

性别决定区域Y盒(SOX9)是SOX基因家族中的一员，在谱系限制、终末分化和干细胞特性维持中作为干细胞相关转录因子发挥作用，同时其对于维持各类肿瘤干细胞的增殖、自我更新和致瘤性亦具有重要的作用。研究表明，SOX9在胃癌进展过程中发挥重要的作用，并可影响患者生存率，因此，SOX9有望成为胃癌早期诊断和预后评估的标志物[1-2]。本研究拟通过检测SOX9基因在胃癌组织中的表达变化，分析其生物学功能，并探讨其在胃癌的发生、发展中的可能作用机制及临床应用价值。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2018年11月至2019年6月于济宁医学院附属医院就诊的胃癌患者27例。其中男15例，女12例，年龄39～75岁，中位年龄56岁。纳入标准：(1)经影像学检查、组织学检查(腹腔镜、手术等切取组织经病理学确诊)诊断为胃癌的患者。(2)所有纳入患者术前均未接受化疗及放疗等，且所有病例均未患其他肿瘤或风湿性疾病、甲状腺功能亢进等免疫相关性疾病及治疗史，在本次研究前3个月内未使用激素类或免疫抑制类药物[3]。

1.2细胞系、主要试剂及仪器 人胃癌细胞系HGC-27细胞系购自中科院上海细胞库；胎牛血清(上海依科塞公司)；DMEM/high 完全培养基(美国Corning公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen 公司)；慢病毒LV3NC(序列5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)、LV3-homo SOX9-1(序列5′-GCATCCTTCAATTTCTGTATA-3′)、LV3-homo SOX9-2(序列5′-ACTTCTGAACGAGAGCGAGAA-3′)购自上海汉恒科技公司；PrimeScript RT Master Mix 试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒(大连TaKaRa公司)；兔(鼠)抗人SOX9、SOX2、Oct-4、Nanog、E-cadherin和GAPDH抗体(美国CST公司)；HRP标记的羊抗兔(鼠)IgG二抗(美国Abcam公司)。CO2恒温培养箱(美国Thermo公司)；化学发光凝胶成像系统(美国Gene公司)；NanoDrop One分光光度计(美国Thermo公司)；CFX96荧光定量PCR检测系统(美国Bio-Rad公司)。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养及组织采集 取生长状态良好的HGC-27细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM/high完全培养基中，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱内温育。组织标本留取自胃癌患者术中切取的癌组织和距离癌组织5 cm以上的癌旁组织(经病理组织学检查无癌变)。所有标本在离体30 min内分装于不同冻存管中，置于液氮保存备用。

1.3.2RNA提取及实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 取患者癌组织和癌旁组织各50～100 mg，经2.5 g/L胰蛋白酶消化并收集HGC-27细胞，采用异硫氰酸胍-酚氯仿法，按Trizol试剂说明书提取组织及细胞的总RNA。利用NanoDrop One分光光度计检测RNA浓度和纯度，取吸光度(A260/280 nm) 值在1.8～2.0间的样本，置于-80 ℃保存以用于后续试验。按照PrimeScript RT Master Mix 试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，样本置于-20 ℃备用。目的基因及内参引物序列见表1，由广州市锐博生物公司使用Primer Premier 5.0软件设计并合成引物。以cDNA为模板，按照SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒及CFX96荧光定量PCR检测系统进行PCR反应。总反应体系为20 μL，包括2×SYBR Green Ⅰ Master Mix (ROX) 10 μL，上、下游引物(5 mmol/L)各0.5 μL，cDNA 样本1 μL，RNase-free ddH2O 8 μL。循环参数:95 ℃预变性10 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共40个循环，84 ℃时采集荧光信号。以β-actin为内参照，结果用2-ΔΔCt法计算。计算公式:ΔΔCt=[(样本Ct目的基因-样本Ct内参基因)-(对照组Ct目的基因-对照组Ct内参基因)]，每组设置3个复孔，实验重复3次。

表1 SOX9及β-actin基因引物序列及产物片段大小

1.3.3细胞转染 取对数期生长的HGC-27细胞以8×104/孔的密度接种至6孔细胞培养板，待细胞融合度达60%～70%时进行转染，用PBS洗涤板内细胞，按照慢病毒转染说明书稀释各组慢病毒原液至终浓度为1×108TU/mL后，取1 μL加入对应孔内进行转染。实验分为：Sh-ctrl组(加入慢病毒LV3NC转染)、Sh-9-1组(加入慢病毒LV3-homoSOX9-1转染),Sh-9-2组(加入慢病毒LV3-homoSOX9-2转染)。病毒转染8～12 h后更换培养液并加入嘌呤霉素(1 μg/mL)筛选细胞，转染72 h后于共聚焦荧光显微镜下拍照并计数荧光细胞/白光细胞比例以验证敲减效率。

1.3.4western blot 剪取患者新鲜癌组织和癌旁组织组织20～40 mg捣碎，加入预冷的PMSF：RIPA裂解液(1∶250稀释)至EP管中，冰浴下经超声匀浆器充分匀浆后冰浴10 min，移至新EP管中，经4 ℃、12 000×g离心10 min后取上清置于-20 ℃保存备用。细胞总蛋白提取：取1.3.3中转染72 h后的细胞经反复震荡裂解后，将蛋白质样品按30 μg总蛋白质量加入每孔，经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(积层胶采用80 V电压，分离胶采用100 V电压)。电泳结束后将蛋白质电转移(在350 mA恒流条件下转2 h)至PVDF膜上。转膜结束后将膜置于50 g/L脱脂奶粉中封闭1～2 h，TBS/T洗膜10 min，分别加入兔(鼠)抗人SOX9、SOX2、Oct-4、Nanog、E-cadherin和兔抗人GAPDH抗体(1∶800稀释)，4 ℃温育过夜。TBS/T洗膜3次×10 min，加入HRP标记的羊抗兔(鼠) IgG二抗(1∶5 000稀释)室温温育1～2 h，TBS/T洗膜3次，每次10 min；洗涤后加入曝光液进行发光显色，利用化学发光凝胶成像系统进行成像分析，采用Image J软件对条带进行灰度扫描及结果判读。

1.3.5Transwell迁移试验 取转染72 h后的HGC-27细胞，经2.5 g/L胰蛋白酶消化后，用无血清DMEM/high Glucose Hyclone培养液重悬细胞，细胞浓度调整为1×105/mL。取200 μL细胞悬液垂直加入Transwell迁移板上室，下室加入500 μL含10%胎牛血清的培养液。迁移板置于CO2培养箱温育12～18 h后取出小室，PBS洗涤2次，用4%多聚甲醛固定细胞30 min，结晶紫染色15 min，PBS洗涤后，擦净小室内未迁移细胞，晾干后于荧光显微镜下选取多个视野观察并拍照，计数细胞迁移数，实验重复3次。

1.3.6平板克隆试验 取转染72 h后的HGC-27细胞接种至6孔细胞培养板，调整细胞密度为3 000个/孔，每组设3个复孔，置于37 ℃、5%CO2培养箱温育，动态观察细胞生长情况，每3～5 d更换1次培养液，当出现肉眼可见的细胞克隆形成时终止培养，培养周期约7～10 d。弃去板内培养液并用PBS洗涤2次后，4%多聚甲醛固定细胞30 min，结晶紫染色15 min。PBS洗涤，晾干后于10倍光镜下计数克隆细胞数>100个的细胞团个数并进行统计分析，实验重复3次。

2 结果

2.1SOX9基因及蛋白质在胃癌组织中的表达 qRT-PCR结果显示，与癌旁组织相比，胃癌患者肿瘤组织中SOX9基因的表达水平显著上升(t=2.115，P=0.040)。western blot检测结果显示,胃癌组织SOX9蛋白的表达水平较癌旁组织明显升高。见图1。

注：A，western blot检测胃癌组织标本SOX9蛋白表达;B,SOX9蛋白相对表达量(灰度分析);N1～N4为4例癌旁组织标本；T1～T4对应的胃癌组织标本，**，P<0.01；NS，差异无统计学意义。

图1 胃癌患者组织中SOX9蛋白的表达水平

2.2SOX9敲减抑制HGC-27细胞增殖 经慢病毒转染72 h后，荧光显微镜下观察结果显示，本次转染效率在80%以上(图2A)，进一步行qRT-PCR检测结果表明，与阴性对照组(Sh-ctrl)SOX9表达水平(0.99±0.03)相比，Sh-SOX9-1组(0.69±0.10)(t=5.212，P=0.007)、Sh-SOX9-2组(0.59±0.20)(t=3.579,P=0.023)明显下降(F=8.335,P=0.019)。平板克隆试验结果显示，与对照组(Sh-ctrl)克隆细胞形成团数[(74.33±3.21)个]相比，Sh-SOX9-1组[(65.67±3.05)个,t=3.385,P<0.01]、Sh-SOX9-1组[(1.00±1.00)个,t=37.73,P<0.01]均明显减少(F=699.3，P<0.01)。见图2B。

注：A，慢病毒转染72 h后荧光显微镜下转染效率验证；B，SOX9敲减后HGC-27细胞平板克隆形成能力；C，SOX9敲减后克隆计数；*，P<0.05；##，P<0.01。

图2SOX9敲减抑制HGC-27细胞增殖

2.3SOX9敲减抑制HGC-27细胞迁移 Transwell迁移试验结果表明,与Sh-ctrl组[(972.7±36.69)个]相比，Sh-SOX9-1组[(323.3±22.12)个,t=29.93，P<0.01]和Sh-SOX9-2组[(39.67±6.11)个,t=43.44，P<0.01]迁移细胞数量均明显减低(F=1 166，P<0.01),结果见图3。

注：A，SOX9敲减后HGC-27细胞迁移(×10)；B，SOX9敲减后细胞迁移计数；*，P<0.01。

2.4SOX9敲减对肿瘤干细胞标记和分化标记表达的影响 qRT-PCR(图4A)和western blot(图4B)结果均显示，SOX9敲减下调HGC-27细胞中干性基因OCT4、Nanog和SOX2及蛋白质的表达，而上调细胞上皮分化相关基因CK18和MUC1及蛋白质的表达。

注：A，SOX9敲减上调CK18、MUC1基因mRNA的表达，下调SOX2、Nanog和OCT4基因mRNA的表达；B，SOX9敲减后western blot 检测 Sh-ctrl 组、Sh-9-1组和Sh-9-2组E-Caderin、SOX2、Nanog和OCT4蛋白的表达；*，P<0.05，#，P<0.01；NS，差异无统计学意义。

图4SOX9敲减后经qRT-PCR和western blot检测基因及蛋白质的结果

3 讨论

大量研究证实，SOX9基因在甲状腺、前列腺、乳腺、结肠直肠、肾细胞癌和膀胱癌等多种癌症中过量表达，且与不良预后相关[2，4-5]。本研究证实了SOX9基因在胃癌患者肿瘤组织中显著高表达。为了进一步分析其在胃癌转移及复发中的作用，本研究利用慢病毒载体敲减胃癌细胞系中SOX9基因(为避免敲减SOX9基因时脱靶，特设计2种片段即：Sh-SOX9-1和Sh-SOX9-1)，发现经SOX9敲减处理的细胞中SOX9基因及相关蛋白质表达水平明显降低；此外，本研究检测该细胞转染后的增殖及迁移能力，结果发现经SOX9敲减后，细胞迁移力显著受抑制，这表明SOX9参与了胃癌的发生，且SOX9高表达与胃癌肿瘤细胞的增殖、转移密切相关。本研究还发现，SOX9的表达水平与胃癌、胰腺癌等耐药性有关，表现出低整体存活率、低无疾病进展存活率等[6-7]，还可因肿瘤所处阶段、组织部位和侵略性的不同，SOX9的表达水平和位置(细胞质或细胞核)存在一定差异[5]，故而推测SOX9具有成为肿瘤生物标志物的潜在应用价值。在临床上SOX9相关的生物标志物的检测可能有助于不同类型癌症的诊断、预后和治疗，但该分子实际的临床应用还需扩大样本量全面分析。

目前SOX9在肿瘤中的生物学作用机制尚不清楚。SOX9作为机体发育过程中的关键调节因子，参与体内众多复杂的调控机制，同时其也作为干细胞维持干性的相关因子在维持肿瘤干细胞的增殖、自我更新和致瘤性中发挥重要作用[8]。有学者发现，SOX9过表达可激活Wnt/β-连环蛋白途径，参与人肺癌细胞增殖和凋亡的调节[9]。另有研究证实，β-catenin-STAT3通路相关蛋白在胃癌患者组织中的表达水平亦显著升高[10]。因此，我们推测SOX9可能通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路影响细胞增殖和上皮-间质转化(EMT)，从而发挥其生物学功能。本研究检测了经慢病毒转染敲减SOX9后的胃癌细胞系内肿瘤干细胞及EMT相关基因表达，结果发现敲减SOX9明显下调HGC-27细胞中OCT4、Nanog和SOX2基因及蛋白质的表达，使得细胞干性减弱；同时还上调了胃癌细胞分化相关的CK18和MUC1基因及促进上皮标志物E-cadherin蛋白的表达，使其表现出与分化相关的特性。表明SOX9可以调控胃癌细胞干性及其分化，也更进一步地提示了胃癌的发生与肿瘤干细胞出现及EMT过程密切相关[11]。