新型L-酪氨酸二肽衍生物的合成及其抗肿瘤活性

曹 盼,曾晓萍,梁光义*,徐必学*

(1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2.贵州医科大学 省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550014；3.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室/贵州省天然药物工程研究中心，贵州 贵阳 550014)

恶性肿瘤是当今社会面临的最严重的公共卫生问题之一[1-3]。据世界卫生组织统计，2018年全球新增1810万癌症患者，因癌症死亡的患者达960万人[4]。尽管临床上于恶性肿瘤的抗肿瘤药物种类繁多，作用机制各异，但严重的毒副作用以及耐药性、增殖转移等缺陷，导致患者存活率偏低[5-7]。

Scheme 1

小分子二肽类化合物具有广泛的生物活性、高度的靶向专一性、选择性以及低毒副作用等优点[8-12]。某些含有酪氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸残基的多肽类化合物能增强核酸或蛋白的代谢而具有抗肿瘤作用[13-14]，同时该类化合物还有很好的抗炎[15]、抗菌[16]等生物活性。Yen等[17-18]报道了一类含有芴甲氧羰酰基(Fmoc)取代的苯丙氨酸二肽化合物，对HepG2、A549等肿瘤细胞有抑制作用。

本课题组前期研究发现，部分苯甲酸取代的苯丙氨酸二肽衍生物能增加细胞内活性氧簇(ROS)的水平，进而上调P38 MAPK通路的活性，稳定P53、激活P21转录，表现出显著的抗肿瘤活性[19]。进一步研究发现，以L-酪氨酸为原料，引入4-苄氧基苯甲酸基团所得部分二肽衍生物的抗肿瘤活性较高。

因此，本文拟在保留4-苄氧基苯甲酸取代的基础上，设计并合成了一系列新的L-酪氨酸二肽衍生物。以L-酪氨酸甲酯盐酸盐为原料，与苄氧基苯甲酸缩合制得N-对苄氧基苯甲酰基-L-酪氨酸甲酯(1);1经碱水解得N-对苄氧基苯甲酰基-L-酪氨酸(2)；2分别于L-苯丙氨醇或L-酪氨酸甲酯盐酸盐缩合得N-[N-(4-苄氧基-苯甲酰基)-O-甲基-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨醇(3a)或N-[N-(4-苄氧基-苯甲酰基)-O-甲基-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨酸甲酯(3b)；3a或3b经烷基化得到目标化合物4a～4h(Scheme 1)，其结构经1H NMR、13C NMR和MS(ESI)表征。采用MTT法评价了目标化合物对3种肿瘤细胞株的体外抑制活性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

XT-4型熔点仪；Bruker Avance NEO 600 MHz型核磁共振仪(CDCl3或DMSO-d6为溶剂，TMS为内标)。

四氮唑蓝(MTT)，sigma公司；其余所用试剂均为分析纯或化学纯。

1.2 合成

(1)1的合成

取酪氨酸甲酯盐酸盐10.7 g(46.2 mmol)和对苄氧基苯甲酸10.0 g(44.0 mmol)加入500 mL反应瓶中，氩气保护下，依次加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)100 mL、无水二氯甲烷(150 mL)、N-甲基吗啉(NMM)16.1 mL(145 mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)2.7 g(21.9 mmol)，搅拌使其完全溶解；冰浴冷却至0 ℃后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)10.1 g(52.8 mmol)，继续搅拌10 h(TLC检测)。加少量水终止反应，减压回收二氯甲烷，残留物加入乙酸乙酯(500 mL)和蒸馏水(500 mL)，分液，有机层依次用水(200 mL)、1.0 mol·L-1盐酸(200 mL)、饱和NaHCO3溶液(200 mL)以及饱和氯化钠溶液(200 mL)洗涤，无水MgSO4干燥，减压回收溶剂得粗品1，未经进一步纯化直接用于下一步反应。

(2)2的合成

将上一步所得粗品117.8 g(44.0 mmol)加入300 mL二氯甲烷部分溶解，搅拌下加入1.0 mol·L-1NaOH溶液175 mL(175 mmol)，体系中有大量白色固体析出，搅拌下反应2 h(TLC检测)。以浓盐酸调至pH 2～3，静置，大量白色固体析出时过滤，滤饼用蒸馏水洗涤至pH呈中性，真空干燥得白色粉末状化合物214.5 g，收率84.3%;1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ:12.66(s,1H),9.17(s,1H),8.57～8.39(m,1H),7.88～7.73(m,2H),7.46(d,J=7.1 Hz,2H),7.40(t,J=7.6 Hz,2H),7.37～7.31(m,1H),7.15～7.03(m,4H),6.72～6.61(m,2H),5.17(s,2H),4.60～4.41(m,1H),3.13～3.01(m,1H),3.01～2.88(m,1H)。

(3)3a～3b的合成(以3a为例)

取化合物2a14.3 g(36.5 mmol)和L-苯丙氨醇6.1 g(40.2 mmol)于500 mL反应瓶中，氩气保护下，加入DMF(30 mL)、无水二氯甲烷(120 mL)和NMM 13.4 mL(120 mmol)，搅拌溶解完全，冰浴冷却至0 ℃后缓慢滴加氯甲酸异丁酯(IBCF)5.1 mL(39.1 mmol)和无水二氯甲烷(20 mL)的混合溶液，滴毕，搅拌下反应11 h(TLC检测)。加少量水终止反应，减压回收二氯甲烷，加入蒸馏水(500 mL)、乙酸乙酯(500 mL)，分液，乙酸乙酯层依次用水(200 mL)、1.0 mol·L-1盐酸(200 mL)、饱和NaHCO3溶液(200 mL)以及饱和氯化钠溶液(200 mL)洗涤，MgSO4干燥，减压回收溶剂，残余物经乙酸乙酯重结晶得白色固体化合物3a14.8 g，收率77.2%;1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ:9.12(s,1H),8.26(d,J=8.1 Hz,1H),7.84～7.73(m,3H),7.47(d,J=7.3 Hz,2H),7.40(t,J=7.5 Hz,2H),7.37～7.31(m,1H),7.23～7.19(m,2H),7.18(t,J=7.4 Hz,2H),7.12(t,J=7.2 Hz,1H),7.10～7.04(m,4H),6.67～6.56(m,2H),5.18(s,2H),4.88～4.73(m,1H),4.62～4.52(m,1H),3.96～3.83(m,1H),3.35～3.23(m,2H),2.94～2.78(m,3H),2.70～2.62(m,1H)。

用类似的方法合成N-[N-(4-苄氧基-苯甲酰基)-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨酸甲酯(3b)：白色粉末，收率58.1%,m.p.192～193 ℃;1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ:9.16(s,1H),8.44(d,J=7.3 Hz,1H),8.32(d,J=8.4 Hz,1H),7.80～7.74(m,2H),7.46(d,J=7.5 Hz,2H),7.40(t,J=7.5 Hz,2H),7.34(t,J=7.3 Hz,1H),7.26～7.16(m,5H),7.14～7.09(m,2H),7.09～7.04(m,2H),6.67～6.60(m,2H),5.17(s,2H),4.68～4.60(m,1H),4.55～4.48(m,1H),3.59(s,3H),3.06(dd,J=14.0 Hz,6.0 Hz,1H),3.03～2.92(m,2H),2.84(dd,J=14.0 Hz,10.8 Hz,1H);13C NMR(DMSO-d6,151 MHz)δ:172.4,172.3,166.1,161.1,156.1,137.5,137.2,130.5,129.7,129.6,128.9,128.8,128.7,128.4,128.2,127.0,126.9,115.3,114.7,69.8,55.3,54.2,52.3,37.1,36.6;MS(ESI)m/z:575.3{[M+Na]+}。

(4)4a～4i的合成(以4a为例)

取化合物3a0.3 g(0.6 mmol)于25 mL反应瓶，加入4 mL DMF溶解，依次加入K2CO30.2 g(1.4 mmol)和38 μL CH3I(0.6 mmol)，氩气保护下，搅拌下反应82 h(TLC检测)。加入适量水和乙酸乙酯，分液，乙酸乙酯层依次用水和饱和氯化钠溶液洗涤，无水MgSO4干燥，浓缩，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇=20/1,V/V)纯化得4a0.2 g。

用类似的方法合成4b～4h。

N-[N-(4-苄氧基-苯甲酰基)-O-甲基-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨醇(4a)：白色粉末，收率64.5%,m.p.182～183 ℃;1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ:8.30(d,J=8.5 Hz,1H),7.82(d,J=8.4 Hz,1H),7.79(d,J=8.7 Hz,2H),7.46(d,J=6.9 Hz,2H),7.40(t,J=7.5 Hz,2H),7.34(t,J=7.3 Hz,1H),7.26～7.19(m,4H),7.18(t,J=7.4 Hz,2H),7.12(t,J=7.2 Hz,1H),7.07(d,J=8.8 Hz,2H),6.80(d,J=8.6 Hz,2H),5.17(s,2H),4.82(t,J=5.4 Hz,1H),4.64～4.57(m,1H),3.95～3.86(m,1H),3.68(s,3H),3.38～3.31(m,1H),3.32～3.25(m,1H),2.96(dd,J=13.8 Hz,4.6 Hz,1H),2.92～2.82(m,2H),2.67(dd,J=13.7 Hz,8.0 Hz,1H);13C NMR(DMSO-d6,151 MHz)δ:171.6,166.0,161.1,158.1,139.4,137.2,130.7,130.6,129.7,129.6,128.9,128.5,128.4,128.2,127.0,126.4,114.7,113.9,69.8,62.7,55.5,55.4,52.9,36.9,36.8;MS(ESI)m/z:561.4{[M+Na]+}。

2016年起开始全面施行的《居住证暂行条例》为城市迁入人口提供了多项公共福利和便利。然而从社会权角度观之，利益是构成权利的要素，但不是权利的本身。权利是集资格、利益、主张和权能、自由等多重要素于一体的概念。从更为深刻的意义讲，权利的存在是一种制度规范，其功能不是个体的绝对幸福，而是消除大多数人不幸的社会根源[6]。从利益与权利的逻辑关系来看，利益可能产生于权利之前，但利益只有在权利规范形成之后才能得到稳定和长久的保障，否则，利益存在是时效性的，缺乏稳定的。《暂行条例》所能发挥的功能并不是法律意义上的“赋权”，而只是政策上的“获益”。

N-[N-(4-苄氧基-苯甲酰基)-O-甲基-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨酸甲酯(4b)：白色固体，收率63.4%,m.p.194～195 ℃;1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ:8.48(d,J=7.4 Hz,1H),8.36(d,J=8.5 Hz,1H),7.78(d,J=8.9 Hz,2H),7.46(d,J=6.7 Hz,2H),7.40(t,J=7.6 Hz,2H),7.37～7.31(m,1H),7.28～7.21(m,6H),7.21～7.16(m,1H),7.06(d,J=8.9 Hz,2H),6.81(d,J=8.7 Hz,2H),5.17(s,2H),4.72～4.62(m,1H),4.55～4.48(m,1H),3.68(s,3H),3.59(s,3H),3.06(dd,J=13.8,5.9 Hz,1H),3.03～2.95(m,2H),2.88(dd,J=13.8 Hz,10.8 Hz,1H);13C NMR(DMSO-d6,151 MHz)δ:172.3,172.3,166.1,161.1,158.2,137.5,137.1,130.7,130.6,129.7,129.6,128.9,128.7,128.4,128.3,127.1,126.9,114.7,113.9,69.8,55.3,55.2,54.2,52.3,37.1,36.5;MS(ESI)m/z:589.2{[M+Na]+}。

N-[N-(4-苄氧基-苯甲酰基)-O-乙基-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨醇(4c)：白色粉末，收率60.1%,m.p.196～197 ℃;1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ:8.30(d,J=8.4 Hz,1H),7.82(d,J=8.4 Hz,1H),7.79(d,J=8.8 Hz,2H),7.46(d,J=6.9 Hz,2H),7.40(t,J=7.6 Hz,2H),7.37～7.31(m,1H),7.24～7.15(m,6H),7.15～7.09(m,1H),7.07(d,J=8.9 Hz,2H),6.77(d,J=8.7 Hz,2H),5.17(s,2H),4.82(t,J=5.5 Hz,1H),4.63～4.56(m,1H),3.93(q,J=6.9 Hz,2H),3.92～3.86(m,1H),3.37～3.31(m,1H),3.32～3.25(m,1H),2.95(dd,J=13.9 Hz,4.6 Hz,1H),2.90～2.82(m,2H),2.66(dd,J=13.6 Hz,8.0 Hz,1H),1.27(t,J=7.0 Hz,3H);13C NMR(DMSO-d6,151 MHz)δ:171.6,166.1,161.1,157.4,139.4,137.2,130.6,130.6,129.7,129.6,128.9,128.5,128.4,128.2,127.0,126.4,114.7,114.4,69.8,63.2,62.7,55.5,52.9,36.9,36.8,15.1;MS(ESI)m/z:575.5{[M+Na]+}。

N-[N-(4-苄氧基-苯甲酰基)-O-烯丙基-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨醇(4d)：白色粉末，收率74.4%,m.p.198～199 ℃;1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ:8.29(d,J=8.4 Hz,1H),7.80(d,J=8.3 Hz,1H),7.77(d,J=8.4 Hz,2H),7.45(d,J=7.5 Hz,2H),7.39(t,J=7.5 Hz,2H),7.32(t,J=7.3 Hz,1H),7.22～7.13(m,6H),7.11(t,J=7.2 Hz,1H),7.05(d,J=8.5 Hz,2H),6.80(d,J=8.3 Hz,2H),6.03～5.95(m,1H),5.34(dd,J=17.2 Hz,2.1 Hz,1H),5.23～5.18(m,1H),5.16(s,2H),4.79(t,J=5.5 Hz,1H),4.62～4.55(m,1H),4.47(d,J=5.2 Hz,2H),3.92～3.85(m,1H),3.35～3.29(m,1H),3.30～3.22(m,1H),2.94(dd,J=13.9,4.6 Hz,1H),2.90～2.80(m,2H),2.65(dd,J=13.7 Hz,8.0 Hz,1H);13C NMR(DMSO-d6,151 MHz)δ:171.6,166.0,161.1,157.1,139.4,137.2,134.3,130.9,130.6,129.7,129.7,128.9,128.5,128.4,128.2,127.0,126.3,117.7,114.7,114.6,69.8,68.5,62.7,55.5,52.9,36.9,36.8;MS(ESI)m/z:587.5{[M+Na]+}。

N-[N-(4-苄氧基-苯甲酰基)-O-二甲氨基丙基-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨醇(4e)：白色粉末，收率57.8%,m.p.181～182 ℃;1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ:8.30(d,J=8.4 Hz,1H),7.82(d,J=8.4 Hz,1H),7.79(d,J=8.6 Hz,2H),7.46(d,J=7.5 Hz,2H),7.40(t,J=7.5 Hz,2H),7.34(t,J=7.3 Hz,1H),7.24～7.15(m,6H),7.12(t,J=7.1 Hz,1H),7.07(d,J=8.5 Hz,2H),6.78(d,J=8.4 Hz,2H),5.17(s,2H),4.80(t,J=5.5 Hz,1H),4.64～4.54(m,1H),4.02～3.80(m,3H),3.34～3.25(m,2H),2.95(dd,J=13.9 Hz,4.5 Hz,1H),2.91～2.82(m,2H),2.67(dd,J=13.7 Hz,8.0 Hz,1H),2.31(t,J=7.1 Hz,2H),2.12(s,6H),1.79(p,J=6.7 Hz,2H);13C NMR(DMSO-d6,151 MHz)δ:171.6,166.0,161.1,157.5,139.5,137.2,130.7,130.6,129.7,129.7,128.9,128.5,128.4,128.2,127.0,126.3,114.7,114.4,69.8,66.1,62.7,56.2,55.5,52.9,45.6,36.9,36.9,27.4;MS(ESI)m/z:610.5{[M+H]+}。

N-[N-(4-苄氧基-苯甲酰基)-O-乙酸乙酯基-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨醇(4f)：白色粉末，收率51.5%,m.p.178～179 ℃;1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ:8.31(d,J=8.5 Hz,1H),7.86～7.74(m,3H),7.46(d,J=7.0 Hz,2H),7.43～7.36(m,2H),7.37～7.30(m,1H),7.24～7.14(m,6H),7.16～7.09(m,1H),7.11～7.02(m,2H),6.84～6.76(m,2H),5.17(s,2H),4.81(t,J=5.4 Hz,1H),4.69(s,2H),4.63～4.55(m,1H),4.13(q,J=7.2 Hz,2H),3.95～3.85(m,1H),3.37～3.31(m,1H),3.32～3.25(m,1H),2.95(dd,J=13.9,4.5 Hz,1H),2.92～2.82(m,2H),2.66(dd,J=13.7 Hz,7.9 Hz,1H),1.17(t,J=7.2 Hz,3H);13C NMR(DMSO-d6,151 MHz)δ:171.6,169.3,166.1,161.1,156.5,139.4,137.2,131.6,130.6,129.7,129.7,128.9,128.5,128.4,128.2,127.0,126.4,114.7,114.5,69.8,65.1,62.7,61.0,55.4,52.9,36.9,36.8,14.5;MS(ESI)m/z:633.3{[M+Na]+}。

N-[N-(4-苄氧基-苯甲酰基)-O-二甲氨基乙基-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨酸甲酯(4h)：白色固体，收率56.1%,m.p.164～165 ℃;1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ:8.45(d,J=7.5 Hz,1H),8.34(d,J=8.5 Hz,1H),7.77(d,J=8.4 Hz,2H),7.49～7.43(m,2H),7.43～7.37(m,2H),7.37～7.31(m,1H),7.29～7.13(m,7H),7.06(d,J=8.2 Hz,2H),6.80(d,J=8.4 Hz,2H),5.17(s,2H),4.74～4.59(m,1H),4.55～4.45(m,1H),3.97(t,J=5.9 Hz,2H),3.58(s,3H),3.11～3.02(m,1H),3.02～2.94(m,2H),2.93～2.83(m,1H),2.58(t,J=5.7 Hz,2H),2.19(s,6H);13C NMR(DMSO-d6,151 MHz)δ:172.3,172.3,166.1,161.1,157.4,137.5,137.2,130.7,130.6,129.7,129.6,128.9,128.7,128.4,128.2,127.0,126.9,114.7,114.5,69.8,66.0,58.2,55.2,54.2,52.3,45.9,37.1,36.5;MS(ESI)m/z:624.2{[M+H]+}。

1.3 抗肿瘤活性测试

以阿霉素为阳性对照，采用MTT法[20]测试了化合物对白血病细胞(K562)、人肺癌细胞(A549)和人肝癌细胞(HepG2)的体外抑制活性。

2 结果与讨论

2.1 合成

以L-酪氨酸甲酯盐酸盐为原料与对苄氧基苯甲酸缩合时，若采用混酐法缩合，所需产物收率很低，可能是由于对苄氧基对苯甲酸的供电子作用，使其反应性降低所致。本实验采用碳二亚胺类缩合剂EDCI与DMAP、NMM在DMF-DCM溶剂系统下高效、专一的促进酰胺键的形成。该方法不仅收率较高(80.3%～84.3%)，且后处理较为简便，副产物水溶性脲经溶剂萃取即可除去。

2.1 抗肿瘤活性

目标化合物3b和4a～4h对白血病细胞(K562)、人肺癌细胞(A549)和人肝癌细胞(HepG2)等3种细胞株的抗肿瘤活性测试抑制活性见表1。从表1可以看出：①合成的化合物对HepG2细胞有一定的抑制活性，化合物4e、4g和4h对三种细胞株均有一定的抑制活性。②通过对比，当R1为-(CH2)2N(CH3)2或-(CH2)3N(CH3)2时，抑制活性明显增强。其中化合物4e对HepG2和K562细胞的抑制活性均优于阳性对照药阿霉素，其IC50分别为0.41和11.77 μmol·L-1，具有进一步的研究价值。

表 1 3b和4a～4h的体外抗肿瘤活性*Table 1 In vitro antitumor activities of 3b and 4a～4h

*N/A:not available。

合成了9个新型的酪氨酸二肽类衍生物(3b,4a～4h)，并采用MTT法测试了化合物对A549、K562和HepG2肿瘤细胞株的抑制活性。所有化合物对HepG2具有抑制活性，化合物4e、4g和4h对3种细胞株均有一定的抑制活性，特别是4e对HepG2和K562细胞的抑制活性均优于阳性对照阿霉素，具有进一步研究的价值。